microRNA 是一種含有約 22 個(gè)核苷酸的小型非編碼 RNA 鏈，它們能通過(guò)與靶 mRNA 的3′UTR（非編碼區(qū)）*互補(bǔ)導(dǎo)致 mRNA 降解。已知MicroRNAs（miRNA）廣泛參與心血管疾病發(fā)病機(jī)制中的基因調(diào)控，包括心肌細(xì)胞肥大、纖維化和凋亡。miRNA 表達(dá)譜已在心臟中鑒定出 miRNA-499（miR-499）、miRNA-208a（miR-208a），這些 miRNAs 在應(yīng)對(duì)應(yīng)激的心肌細(xì)胞肥大和纖維化中起重要作用。

與其他 RNAs 一樣，miRNA 也是轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。因此，一種 miRNA 可以調(diào)節(jié)另一種 miRNA 的表達(dá)。 miR-499 對(duì) miR-208a 的調(diào)節(jié)增加了 miR-499 調(diào)節(jié)的心臟 microRNA 的數(shù)量。

B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）在人體中由BCL2基因編碼，是 Bcl-2 調(diào)節(jié)蛋白家族的創(chuàng)始成員，也是線(xiàn)粒體細(xì)胞死亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)成分。Bcl-2 位于線(xiàn)粒體外膜，在促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制促凋亡蛋白方面發(fā)揮重要作用。

病理?xiàng)l件下心房成纖維細(xì)胞的增殖在心房電重構(gòu)和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中起重要作用。研究報(bào)道，心房心臟成纖維細(xì)胞通過(guò)間隙連接施加電緊張，影響心肌細(xì)胞的電耦合性形式并引起心房顫動(dòng)。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行與體內(nèi)動(dòng)態(tài)拉伸超負(fù)荷相當(dāng)?shù)捏w外各種水平的循環(huán)機(jī)械拉伸已得到很好的研究，包括研究心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和新生大鼠心肌細(xì)胞中基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制的研究。然而，機(jī)械拉伸對(duì)心房心臟成纖維細(xì)胞的影響鮮有報(bào)道。

拉伸的心房心臟成纖維細(xì)胞和血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷心臟中 miR-499、miR-208a 和 Bcl-2 之間的關(guān)系尚未明確。此外，miR-499 和 miR-208a 誘導(dǎo)拉伸的心房心臟成纖維細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)制仍然知之甚少。因此，中國(guó)臺(tái)灣天主教輔仁大學(xué)醫(yī)學(xué)院、新光醫(yī)院心臟內(nèi)科及急診科的一項(xiàng)研究旨在探討調(diào)節(jié) miR-499 和 miR-208a 對(duì)拉伸的心房成纖維細(xì)胞和容量超負(fù)荷誘發(fā)心力衰竭大鼠模型中 Bcl-2 蛋白表達(dá)的分子機(jī)制。

機(jī)械拉伸抑制人心臟成纖維細(xì)胞-成人心房中的 miR-208a，但增強(qiáng) miR-499 和 Bcl-2 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）用于測(cè)量 miR-208a 和 miR-499 水平，以檢查機(jī)械拉伸對(duì)人心臟成纖維細(xì)胞-成人心房（HCF-aa）中 miR-208a 和 miR-499 的影響。1 Hz，20% 伸長(zhǎng)率的機(jī)械拉伸持續(xù) 0.5-2 小時(shí)導(dǎo)致 miR-208a 表達(dá)顯著高于對(duì)照細(xì)胞，然而，拉伸 4-8 小時(shí)將 miR-208a 的表達(dá)恢復(fù)到控制水平（圖1 A）。機(jī)械拉伸 2-8 小時(shí)導(dǎo)致 miR-499 顯著升高（圖1 B）。此外，拉伸 1 h 時(shí) Bcl-2 mRNA 的表達(dá)顯著低于對(duì)照，機(jī)械拉伸 2-8 h 時(shí) Bcl-2 mRNA 和蛋白質(zhì)上調(diào)（圖1 C-E）。

圖1   機(jī)械拉伸抑制了人心肌成纖維細(xì)胞-成人心房（HCF-aa）中的miR-208a，但增強(qiáng)了miR-499，Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白的表達(dá)。

MiR-499 降低拉伸的 HCF-aa 中 pri-miR-208a 熒光素酶活性

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，位于 pri-miR-208a 基因位點(diǎn)下游 57bp的人類(lèi) pri-miR-208a ，具有 miR-499-5p 的結(jié)合位點(diǎn)。機(jī)械拉伸 1 小時(shí)顯著增加 HCF-aa 中的 pri-miR-208a 熒光素酶活性。然而，用 miR-499 預(yù)處理抑制了拉伸的 HCF-aa 中 pri-miR-208a 熒光素酶活性的表達(dá)。pri-miR-208a 上 miR-499 結(jié)合位點(diǎn)的突變通過(guò) 1 小時(shí)的拉伸消除了對(duì) pri-miR-208a 熒光素酶活性的抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明，pri-miR-208a 是 miR-499 的靶標(biāo)。

機(jī)械拉伸通過(guò) miR-208a 抑制 Bcl-2-3'UTR 熒光素酶活性

Bcl-2-3'UTR 包含 miR-208a 結(jié)合位點(diǎn)，而突變體 Bcl-2-3'UTR 具有 miR-208a 結(jié)合位點(diǎn)的突變。熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，機(jī)械拉伸 1 小時(shí)可抑制 Bcl-2-3'UTR 熒光素酶活性。然而，這種效應(yīng)被 Bcl-2-3'UTR 中 miR-208a 結(jié)合位點(diǎn)的突變抑制。添加 antagomir-208a 增強(qiáng)了拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2-3'UTR 熒光素酶活性，但對(duì)突變體 Bcl-2-3'UTR 沒(méi)有影響。添加突變型 miR-208a 對(duì) Bcl-2-3'UTR 熒光素酶活性沒(méi)有影響。這些結(jié)果表明，Bcl-2-3'UTR 中的 miR-208a 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要。

MiR-499 抑制拉伸的 HCF-aa 中 miR-208a 的表達(dá)

與單獨(dú)拉伸相比，miR-499 過(guò)表達(dá)顯著抑制了機(jī)械拉伸 1 小時(shí)的 HCF-aa 中 miR-208a 的表達(dá)（圖2 A）。然而，添加突變型 miR-499 或 antagomir-499 并沒(méi)有抑制 miR-208a 的表達(dá)。添加 antagomir-499 通過(guò) 4 小時(shí)的拉伸減弱了 miR-208a 的下調(diào)（圖2 B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-208a 表達(dá)的下調(diào)可能是由于機(jī)械拉伸過(guò)程中 miR-499 的上調(diào)所致。

圖2   miR‐499通過(guò)miR-208a影響Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)在拉伸的人心肌成纖維細(xì)胞-成人心房（HCF-aa）中的表達(dá)。

機(jī)械拉伸通過(guò) miR-208a 影響 Bcl-2 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)

與單獨(dú)拉伸相比，添加 miR-208a 顯著抑制機(jī)械拉伸 4 h 誘導(dǎo)的 Bcl-2 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖2 C-E），而添加突變型 miR-208a 或 antagomir-208a 對(duì)這種 Bcl-2 表達(dá)沒(méi)有影響。與單獨(dú)拉伸相比，Bcl-2小干擾RNA（siRNA）抑制機(jī)械拉伸4小時(shí)誘導(dǎo)的Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，而添加亂序siRNA對(duì)這種抑制作用沒(méi)有影響。用野生型 miR-208a 預(yù)處理對(duì)沒(méi)有拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2 表達(dá)沒(méi)有影響。

免疫組織化學(xué)染色證實(shí)機(jī)械拉伸 4 小時(shí)后 HCF-aa 中 Bcl-2 表達(dá)增加（圖3 A、B）。添加野生型 miR-208a 抑制了 Bcl-2 表達(dá)，而用突變型 miR-208a 或 antagomir-208a 預(yù)處理沒(méi)有影響（圖3 C–E）。野生型 miR-208a 對(duì)沒(méi)有拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2 表達(dá)沒(méi)有影響（圖3 F）。添加 Bcl-2 siRNA 在拉伸 4 小時(shí)后抑制 HCF-aa 中 Bcl-2 的表達(dá)，而添加亂序 siRNA 對(duì)這種抑制沒(méi)有影響（圖3 G、H）。這些結(jié)果表明，機(jī)械拉伸 4 小時(shí)會(huì)通過(guò) miR-208a 影響 Bcl-2 的表達(dá)。

圖3   免疫組織化學(xué)染色證實(shí)了Bcl-2在人心肌成纖維細(xì)胞-成人心房（HCF-aa）中的表達(dá)。

圖4   熒光素異硫氰酸酯-膜聯(lián)蛋白V在各種條件下對(duì)人心肌成纖維細(xì)胞-成人心房（HCF-aa）的分析。

MiR-499 通過(guò) miR-208a 調(diào)節(jié) AV 分流大鼠心肌 Bcl-2 的表達(dá)

在主動(dòng)脈腔靜脈（AV）分流的成年大鼠中誘導(dǎo)容量超負(fù)荷，研究了 miR-499 和 miR-208a 對(duì)體內(nèi) Bcl-2 表達(dá)的影響。AV 分流導(dǎo)致心肌 miR-208a 表達(dá)從 3 天到 5 天顯著增加，但從 7 天到 14 天下降（圖5 A）。此外，miR-499 的表達(dá)從 7 天增加到 14 天（圖5 B）。野生型 miR-499 過(guò)表達(dá)在 5 天時(shí)顯著降低了 miR-208a 的表達(dá)，但添加突變型 miR-499 和 antagomir-499 對(duì) miR-208a 的表達(dá)沒(méi)有影響（圖5 C）。

與假手術(shù)大鼠相比，AV 分流大鼠心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)在 7 至 14 天顯著被誘導(dǎo)（圖5 D–F）。進(jìn)行 AV 分流 14 天后，大鼠心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著增加（圖5 G–I）。用 miR-208a 預(yù)處理顯著抑制了這種增加，而添加突變型 miR-208a 和 antagomir-208a 沒(méi)有影響。與 AV 分流大鼠相比，用 Bcl-2 siRNA 預(yù)處理可抑制心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白的表達(dá)，而添加亂序 siRNA 對(duì)這種抑制沒(méi)有影響。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-208a 的表達(dá)可以受 miR-499 的調(diào)節(jié)，并且可以調(diào)節(jié)容量超負(fù)荷大鼠心臟中 Bcl-2 的表達(dá)。

圖5   miR‐499通過(guò)miR‐208a在具有AV分流的大鼠中調(diào)節(jié)心肌Bcl-2表達(dá)。

圖6   miR‐208a通路通過(guò)人心肌成纖維細(xì)胞-成人心房（HCF-aa）中miR-499介導(dǎo)了Bcl-2表達(dá)。miR-499的關(guān)鍵作用可能為心血管疾病的microRNA靶向治療帶來(lái)潛在的應(yīng)用前景。

總之，研究發(fā)現(xiàn) miR-208a 是 miR-499 的直接靶標(biāo)，并且 miR-208a 的抑制緩解了機(jī)械拉伸的 HCF-aa 中 Bcl-2 的抑制（圖6），還觀察到 antagomir-208a 過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了容量超負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭模型中 Bcl-2 的表達(dá)。microRNA 介導(dǎo)的 microRNA 調(diào)控的結(jié)果是 microRNA 靶向的心血管治療的潛在新應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：Chua SK, Wang BW, Yu YJ, Fang WJ, Lin CM, Shyu KG. Cyclic stretching boosts microRNA-499 to regulate Bcl-2 via microRNA-208a in atrial fibroblasts. J Cell Mol Med. 2021 Mar;25(6):3113-3123. doi: 10.1111/jcmm.16373. Epub 2021 Feb 18. PMID: 33605072; PMCID: PMC7957261.

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