近年來(lái)，針對(duì)程序性死亡配體1（PD-L1）和程序性死亡受體1（PD-1）的抗體免疫療法在肺癌治療中取得了很大進(jìn)展。PD-1 可以與其配體 PD-L1 相互作用，在腫瘤微環(huán)境中負(fù)調(diào)控 T 細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避 T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視。先前的研究結(jié)果表明，具有抑制 PD-L1 能力的小分子可能是增強(qiáng)抗腫瘤免疫的關(guān)鍵方法。

PD-L1 表達(dá)的調(diào)控涉及多種機(jī)制，其中 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 是多種癌癥類型中 PD-L1 的主要來(lái)源。IFN-γ，主要由 CD8⁺ T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，在腫瘤微環(huán)境中既有利又有弊。IFN-γ 誘導(dǎo) PD-L1 表達(dá)以抑制細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的功能并促進(jìn)多種癌癥類型的腫瘤生長(zhǎng)。因此，干擾 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 的藥物可能具有應(yīng)用于免疫治療的潛力。

甘草查耳酮A （Licochalcone A ，圖1 A）是一種從豆科植物甘草中提取的查耳酮類化合物。研究表明，LCA 通過(guò)增加肺癌細(xì)胞中 C/EBP 同源蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬并降低細(xì)胞活力。它還通過(guò)誘導(dǎo)多種類型的癌細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗癌作用，并通過(guò)調(diào)節(jié) PI3K/Akt 通路抑制口腔鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

以往的研究主要集中在 LCA 對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，而中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（澳門大學(xué)）、中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)曾旨在證明 LCA 的另一種潛在的抗癌機(jī)制，即通過(guò)下調(diào) IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的免疫逃逸。

LCA 對(duì)肺癌細(xì)胞中 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 蛋白表達(dá)的影響

首先，人肺癌 A549 細(xì)胞系用 5、10、15 和 20 μM LCA 與或不與 IFN-γ（5 ng/ml）處理 24 小時(shí)，使用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定 PD-L1 蛋白表達(dá)。如圖1 B，IFN-γ 誘導(dǎo) PD-L1 多條帶表達(dá)，這可能是由于 PD-L1 的糖基化。10、15 和 20 μM LCA 在 A549 細(xì)胞中抑制 IFN-γ 觸發(fā)的 PD-L1 表達(dá)，而 5 μM LCA 引起 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 的條帶偏移，可能是因?yàn)?nbsp;5 μM LCA 部分干擾了 PD- L1 表達(dá)并進(jìn)一步影響 PD-L1 糖基化。

接下來(lái)選擇 10 μM LCA 進(jìn)行進(jìn)一步研究。用 10 μM LCA 預(yù)處理細(xì)胞 1 小時(shí)，然后用 5 ng/ml IFN-γ 處理 0.5、3、6、12、24 小時(shí)。如圖1 C，10 μM LCA 在 6h-24h 內(nèi)在 A549 細(xì)胞中抑制 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 表達(dá)。

為了進(jìn)一步證實(shí) LCA 對(duì) IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)研究了另外兩種肺癌細(xì)胞系NCI-H1299 和 NCI-H1650。如圖1 F-I ，10 μM LCA 還消除了 NCI-H1299 和 NCI-H1650 細(xì)胞中 IFN-γ 誘導(dǎo)的表達(dá)。這些結(jié)果表明，10 μM LCA 可抑制 IFN-γ 觸發(fā)的肺癌細(xì)胞中 PD-L1 膜定位。

圖1 LCA 對(duì) IFN-γ 誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞 PD-L1 蛋白表達(dá)的影響。

LCA 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖和存活的影響

為了確定 PD-L1 表達(dá)的生理相關(guān)性，使用共培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)估 A549 細(xì)胞 PD-L1 水平對(duì) Jurkat T（人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞 ）細(xì)胞功能的影響（圖2 A ）。首先測(cè)量了共培養(yǎng)系統(tǒng)中 Jurkat T 細(xì)胞的增殖。與對(duì)照組相比，IFN-γ（5 ng/ml）處理組的 Jurkat T 細(xì)胞增殖受到抑制，而這種增殖抑制作用在 10 μM LCA 存在時(shí)恢復(fù)，1 μM RUXO 處理則部分逆轉(zhuǎn)（圖2 B、C）。

接下來(lái)，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中分析 Jurkat T 細(xì)胞的凋亡。在圖2 D、E 中，位于 Q2 和 Q3 上的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。與對(duì)照組（2.18% ± 0.25%）相比，5 ng/ml IFN-γ 處理的 A549 細(xì)胞增加了 Jurkat T 細(xì)胞的凋亡率（17.34% ± 4.65%）。此外，在 10 μM LCA 或 1 μM RUXO 存在下，IFN-γ 處理的 A549 細(xì)胞對(duì) Jurkat T 細(xì)胞的促凋亡作用受到抑制。結(jié)果表明，10 μM LCA 可減少共培養(yǎng)系統(tǒng)中的 Jurkat T 細(xì)胞凋亡。

圖2 LCA 對(duì) Jurkat T 細(xì)胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖和存活的影響。（A）共培養(yǎng)系統(tǒng)的程序。（B、C）共培養(yǎng) 48 小時(shí)后，測(cè)量Jurkat 細(xì)胞增殖的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。RUXO：魯索替尼。（D、E）在 24 小時(shí)共培養(yǎng)后評(píng)估凋亡的 Jurkat 細(xì)胞。

LCA 對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響

由于 GSK3β 等多種因素介導(dǎo) PD-L1蛋白降解，LCA 可能通過(guò)蛋白降解途徑下調(diào) IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1。如圖3 B，蛋白酶體抑制劑 MG-132 和溶酶體抑制劑氯喹（CQ）均未能逆轉(zhuǎn) 10 μM LCA 介導(dǎo)的 IFN-γ（5 ng/ml）引發(fā)的 A549 細(xì)胞中 PD-L1 表達(dá)的降低。

基于上述結(jié)果，LCA 可能通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成來(lái)消除 IFN-γ 觸發(fā)的 PD-L1 表達(dá)。在此，順鉑CIS（20 μM）和蛋白質(zhì)合成抑制劑 CHX（50 μM）分別用作陰性和陽(yáng)性對(duì)照（圖3 C）。與 CHX 類似，用 10 μM LCA 處理可以抑制蛋白質(zhì)合成。

蛋白質(zhì)翻譯分為兩種類型，即帽依賴性翻譯和非帽依賴性翻譯。帽依賴性翻譯是一種真核翻譯，它依賴于 eIF4e 與 5' 帽的結(jié)合來(lái)啟動(dòng) mRNA 翻譯，而非帽依賴性翻譯不需要 5' 帽，而是需要內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）來(lái)啟動(dòng)翻譯。為了確認(rèn)抑制蛋白質(zhì)合成的結(jié)果，引入了海腎螢光素酶-IRES-螢火蟲螢光素酶（RLUC-IRES-FLUC）質(zhì)粒（圖3 D）。與對(duì)照組相比，RLUC 和 FLUC 強(qiáng)度的倍數(shù)變化分別代表帽依賴性和非帽依賴性翻譯。正如預(yù)期的那樣，10 μM LCA 處理將 RLUC 強(qiáng)度和 FLUC 強(qiáng)度降低了約 40%（圖3 E），表明 10 μM LCA 抑制帽依賴性和非帽依賴性翻譯。

圖3 LCA 對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響。

LCA 對(duì) ROS 生成的影響

據(jù)報(bào)道，ROS 會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成。LCA 是否通過(guò)產(chǎn)生 ROS 來(lái)消除 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 有待進(jìn)一步研究。

首先將 10 μM LCA 分別在 0.25、1、3、6、12 h 點(diǎn)作用于 A549 細(xì)胞，結(jié)果表明，10 μM LCA 在 A549 細(xì)胞中以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo) ROS 生成。H2O2（處理0.25 h）為陽(yáng)性對(duì)照（圖4 A、B）。

然后，在 A549 細(xì)胞12 小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，將抗氧化劑 NAC（5 mM 和 10 mM）與或不與 10 μM LCA 聯(lián)合預(yù)處理 1 小時(shí)，然后用 5 ng/ml IFN-γ 處理 12 小時(shí)。如圖4 C、D，IFN-γ 單組對(duì) ROS 生成無(wú)顯著影響，而 10 μM LCA 和 LCA 加 IFN-γ 均顯著誘導(dǎo) ROS 生成。此外，5 mM 和 10 mM NAC 使 10 μM LCA 誘導(dǎo)的 ROS 生成的 MFI 分別降低了約 45% 和 65%。更重要的是，NAC 還部分逆轉(zhuǎn)了 A549 細(xì)胞中 12 小時(shí)點(diǎn)的 PD-L1 膜定位（圖4 E、F）?；谏鲜鼋Y(jié)果，LCA 可能通過(guò) ROS 產(chǎn)生消除了 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 翻譯。

圖4 LCA 對(duì) ROS 生成的影響。

圖5 圖形概要

LCA 在人肺癌細(xì)胞中下調(diào) IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1蛋白表達(dá)和膜定位，無(wú)論是否抑制 PD-L1 mRNA 水平或促進(jìn)其蛋白降解。LCA 降低了共培養(yǎng)系統(tǒng)中 A549 細(xì)胞中由 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 表達(dá)引起的 Jurkat T 細(xì)胞的凋亡和增殖抑制。引人注目的是，LCA 被證實(shí)是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，它降低了帽依賴性和非帽依賴性翻譯。LCA 抑制 PD-L1 翻譯，可能是由于 4EBP1 磷酸化（Ser 65）的抑制和 PERK-eIF2α 通路的激活。此外，LCA 在肺癌細(xì)胞中以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo) ROS 生成。NAC 不僅抑制由 LCA 觸發(fā)的 ROS 生成，而且還恢復(fù)了 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1 表達(dá)。通過(guò)與 NAC 共處理，LCA 觸發(fā)的 4EBP1 磷酸化（Ser 65）抑制和 PERK-eIF2α 軸的激活均得到恢復(fù)。

該研究發(fā)現(xiàn) LCA 通過(guò)翻譯抑制作用消除 IFN-γ 誘導(dǎo)的 PD-L1，為 LCA 在癌癥免疫治療中的應(yīng)用提供了新的思路。LCA 對(duì)翻譯過(guò)程的確切靶點(diǎn)以及 LCA 對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)的體內(nèi)生物學(xué)作用有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：Yuan LW, Jiang XM, Xu YL, Huang MY, Chen YC, Yu WB, Su MX, Ye ZH, Chen X, Wang Y, Lu JJ. Licochalcone A inhibits interferon-gamma-induced programmed death-ligand 1 in lung cancer cells. Phytomedicine. 2021 Jan;80:153394. doi: 10.1016/j.phymed.2020.153394. Epub 2020 Oct 22. PMID: 33130472.

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