由機(jī)械力刺激引起的正畸牙齒移動(dòng)（OTM）是一種特別的骨重塑過程，需要牙周韌帶（PDL）的參與。在牙齒移動(dòng)過程中，在受壓側(cè)，PDL 被壓縮，牙槽骨被吸收，而骨沉積在與受力方向相反的張力側(cè)被激活。張力區(qū)的骨形成有助于牙齒運(yùn)動(dòng)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

牙周韌帶細(xì)胞（PDLCs）是 PDL 的主要組成細(xì)胞，可以分化成成骨細(xì)胞來合成骨組織。同時(shí)，PDLCs 還通過合成和釋放細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和集落刺激因子為骨沉積提供有利的微環(huán)境。此外，這些因素可能調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移、增殖和分化，已發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移到機(jī)械負(fù)荷的牙周組織并參與移動(dòng)牙齒周圍的骨重塑。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，OTM 期間張力應(yīng)變誘導(dǎo)骨形成的機(jī)制仍不清楚。在湖北省口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室之前的研究中，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）等特定生長(zhǎng)因子和趨化因子顯著上調(diào)。cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）被進(jìn)一步鑒定為該張力應(yīng)變激活反應(yīng)中的核心蛋白之一。

CREB 是一種亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，可通過與保守的啟動(dòng)子序列（TGACGTCA）結(jié)合來調(diào)節(jié)許多 cAMP 反應(yīng)基因。CREB 通過調(diào)節(jié)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子參與各種生物過程，包括細(xì)胞分化、增殖和遷移。

在本研究中，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn) CREB 的表達(dá)和磷酸化在正畸張力應(yīng)變刺激下升高。此外，F(xiàn)GF2 和 SDF-1 的表達(dá)也上調(diào)。假設(shè) CREB 可能通過轉(zhuǎn)錄激活 SDF-1 和 FGF2 并增強(qiáng) BMSCs 的遷移和分化。體外分析結(jié)果表明，PDLCs 中 CREB 的過表達(dá)上調(diào) FGF2 和 SDF-1 的表達(dá)，而 CREB 的抑制減弱了 FGF2 和 SDF-1 的升高。研究進(jìn)一步探索了 CREB 如何反式激活 FGF2 和 SDF-1 啟動(dòng)子，并在其啟動(dòng)子中鑒定了 cAMP 調(diào)節(jié)的增強(qiáng)子元件（CRE）。

應(yīng)用正畸張力應(yīng)變的 PDLCs 增強(qiáng) BMSCs 遷移和成骨分化

為了研究 BMSCs 在張力部位的功能，實(shí)驗(yàn)生成了一個(gè) OTM 小鼠模型。高倍放大圖像顯示張力部位的板層骨形成和骨腔周圍的圓形骨形成（圖1 A）。

為了更詳細(xì)地確定新骨的起源，比較了 PDL 中 Periostin（骨膜蛋白）、OCN 和 αSMA 的表達(dá)。OCN 被認(rèn)為是成熟成骨細(xì)胞和骨形成率的標(biāo)志物。骨膜蛋白已被視為牙周韌帶細(xì)胞的標(biāo)志物。有研究提出，表達(dá) αSMA 的祖細(xì)胞/干細(xì)胞位于 PDL 的血管周圍區(qū)域，可以分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。在移動(dòng)牙齒的張力部位的 PDL 中，αSMA 的表達(dá)與骨膜蛋白的表達(dá)不重疊。αSMA 陽性（αSMA⁺）細(xì)胞和骨膜蛋白陽性（Periostin⁺）細(xì)胞均可檢測(cè)到 OCN（圖1 E）。這些結(jié)果表明，PDL 中 PDLCs 衍生的成骨細(xì)胞和 BMSCs 衍生的成骨細(xì)胞均參與骨形成。

為了更好地了解正畸牙齒移動(dòng)過程中 PDLCs 和 BMSCs 之間的關(guān)聯(lián)，建立了一個(gè)張力應(yīng)變系統(tǒng)，對(duì)牙周韌帶細(xì)胞（PDLCs）施加循環(huán)張力應(yīng)變（CTS，重復(fù) 5 秒拉伸和 5 秒松弛，持續(xù)48小時(shí)）。從應(yīng)用 CTS 的 PDLCs 收集條件培養(yǎng)基并用于人類 BMSCs。與用對(duì)照培養(yǎng)基處理的相比，用 CTS 培養(yǎng)基處理的 BMSCs 顯示 ALP 染色和茜素紅染色增強(qiáng)（圖1 B）。同時(shí)，與對(duì)照處理相比，用 CTS 培養(yǎng)基處理 BMSCs 的細(xì)胞遷移率大大提高（圖1 C、D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，PDLCs 可以響應(yīng)機(jī)械張力應(yīng)變并增強(qiáng) BMSCs 的遷移和分化。

圖1 應(yīng)用張力應(yīng)變的 PDLCs 增強(qiáng)了 BMSCs 的遷移和分化。

正畸張力應(yīng)變誘導(dǎo)的骨形成中 CREB 表達(dá)增加

為了檢查 CREB 是否參與正畸張力應(yīng)變誘導(dǎo)的骨形成，首先評(píng)估了其在機(jī)械負(fù)荷磨牙牙周組織中的表達(dá)。免疫組化染色顯示，OTM 小鼠在第 3、6、12 天的張力部位 P-CREB 表達(dá)顯著增加。在對(duì)照的對(duì)側(cè)部位觀察到較弱的免疫反應(yīng)（圖 2 A 、B）。

為了更詳細(xì)地確定 CREB 的起源，比較了第 3 天實(shí)驗(yàn) OTM 樣品中骨膜蛋白和 CREB 的表達(dá)。骨膜蛋白定位于 PDL。CREB 主要在 Periostin⁺ 細(xì)胞的細(xì)胞核中檢測(cè)到，表明 CREB 表達(dá)在除 BMSCs 之外的 PDLCs 中增加（圖2 C）。實(shí)時(shí) RT-PCR 結(jié)果顯示，體外 CTS 刺激的 PDLCs 中 CREB 的 mRNA 水平在 24、48 和 72 小時(shí)顯著上調(diào)（圖2 D）。免疫印跡結(jié)果還顯示，CREB 和 P-CREB 的表達(dá)在 24 小時(shí)后顯著增加（圖2 E）。

實(shí)驗(yàn)分析了 CTS 應(yīng)用的 PDLCs 中環(huán)磷腺苷（cyclic AMP）的產(chǎn)生。與未處理組相比，CTS 處理的 PDLCs 中環(huán)磷腺苷的表達(dá)從 12 小時(shí)到 48 小時(shí)持續(xù)增加并穩(wěn)定在 72 小時(shí)（圖2 F）。cAMP 對(duì) CTS 的反應(yīng)趨勢(shì)與 CREB 相似但略早于 CREB。這些結(jié)果清楚地表明，在 OTM 期間，在正畸張力應(yīng)變誘導(dǎo)的骨形成期間，PDL 中 cAMP 和 CREB 的表達(dá)增加。

圖2 在正畸張力負(fù)荷下，CREB在牙周韌帶中的表達(dá)增加。

正畸張力應(yīng)變刺激 PDLCs 中 FGF2 和 SDF-1 的表達(dá)

通過實(shí)時(shí) RT-PCR 分析檢查了 CTS 處理的 PDLCs中 FGF2 和 SDF-1 的 mRNA 表達(dá)。結(jié)果顯示，24 小時(shí)后 FGF2 和 SDF-1 的 mRNA 表達(dá)上調(diào)（圖3 A、B）。此外，ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照培養(yǎng)基相比，CTS 處理的 PDLCs 條件培養(yǎng)基中 FGF2 和 SDF-1 的濃度顯著增加（圖3 C、D）。此外還發(fā)現(xiàn)，OTM 模型中牙周韌帶張力部位的 FGF2 和 SDF-1 水平升高。免疫組化染色顯示，F(xiàn)GF2 的表達(dá)在第 3 天和第 6 天顯著增加，然后在第 12 天恢復(fù)正常（圖3 E、F）。SDF-1 在第 3 天高表達(dá)，然后在第 6 天和第 12 天減少（圖3 G、H）。

實(shí)驗(yàn)比較了第 3 天實(shí)驗(yàn) OTM 樣品中骨膜蛋白和 FGF2 或 SDF-1 的表達(dá)。FGF2 和 SDF-1 主要在 Periostin⁺ 細(xì)胞中檢測(cè)到，表明 FGF2 和 SDF-1 是由除 BMSCs 以外的 PDLCs 分泌的（圖 4）。這些發(fā)現(xiàn)表明，機(jī)械張力可以誘導(dǎo) PDLCs 在張力部位表達(dá)和分泌 FGF2 和 SDF-1。

圖3 正畸張力負(fù)荷刺激牙周韌帶中 FGF2 和 SDF-1 的表達(dá)。

圖4 FGF2 和 SDF-1 在 OTM 小鼠模型中由 PDLCs 分泌。

CREB 增強(qiáng) PDLCs 介導(dǎo)的 BMSCs 成骨和遷移

為了確定 PDLCs 中 CREB 表達(dá)是否可以調(diào)節(jié) BMSCs 的成骨和遷移，在 PDLCs 中生成了表達(dá) CREB 或失去轉(zhuǎn)錄活性的顯性陰性形式的 CREB（KCREB）的慢病毒。免疫印跡結(jié)果顯示，CREB 和 KCREB 在慢病毒感染后在 PDLCs 中過表達(dá)。結(jié)果顯示，用來自 CREB 過表達(dá) PDLCs 的條件培養(yǎng)基處理的 BMSCs 的遷移率顯著上調(diào)，而 KCREB 組的遷移率下調(diào)（圖5 A、B）。

此外，還檢查了它們對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。用來自 CREB 過表達(dá)的 PDLCs 的條件培養(yǎng)基處理，BMSCs 的 ALP 活性和礦化能力顯著上調(diào)；而用來自 KCREB 表達(dá)的 PDLCs 的條件培養(yǎng)基處理時(shí)，其下調(diào)（圖5 C、D）。這些數(shù)據(jù)表明，CREB 在 PDLCs 中的表達(dá)可能在調(diào)節(jié)信號(hào)分子分泌中發(fā)揮作用，從而增強(qiáng) BMSCs 的遷移和成骨細(xì)胞分化。

圖5 CREB 增強(qiáng) CTS-PDLCs 介導(dǎo)的 BMSCs 的成骨和遷移。

CREB 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) FGF2 和 SDF-1 的表達(dá)

為了研究 CREB 是否可以調(diào)節(jié) FGF2 和 SDF-1 的表達(dá)，對(duì)感染 PDLCs 的條件培養(yǎng)基進(jìn)行了 ELISA 檢測(cè)。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2 和 SDF-1 的表達(dá)在 CREB 過表達(dá)的 PDLCs 條件培養(yǎng)基中顯著上調(diào)，而在來自 KCREB 表達(dá)的 PDLCs 的條件培養(yǎng)基中下調(diào)（圖6 A、B）。SiRNAs 也被轉(zhuǎn)染到 PDLCs 中以抑制 CREB 的表達(dá)。實(shí)時(shí) RT-PCR 結(jié)果顯示，在 siCREB-b 和 siCREB-c 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 CREB 表達(dá)顯著下調(diào)（圖6 C）。

使用 siCREB-c，檢查了 CREB 的抑制是否可以減弱 CTS 處理的 PDLCs 中 FGF2 和 SDF-1 的升高。ELISA 結(jié)果顯示，siCREB-c 降低了 CTS 處理的 PDLCs 條件培養(yǎng)基中 FGF2 和 SDF-1 的增加（圖6 D、E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，CREB 可能在 CTS 應(yīng)用的 PDLCs 中充當(dāng) FGF2 和 SDF-1 的上游調(diào)控因子。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索了CREB 調(diào)控 FGF2 和 SDF-1 表達(dá)的機(jī)制，分析了 2 kb FGF2 和 SDF1 啟動(dòng)子片段中的潛在調(diào)控元件。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2 啟動(dòng)子在 -1496bp～-1489bp（m2）和 -47bp～-40bp（m5）位點(diǎn)的突變大大降低了 CREB 轉(zhuǎn)錄激活（圖6 F）。對(duì)于 SDF-1 啟動(dòng)子，-1203bp～-1196bp（m2）位點(diǎn)的突變大大減弱了轉(zhuǎn)錄激活（圖6 G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，CREB 通過與 FGF2 啟動(dòng)子的 -1496bp～-1489bp 和 -47bp～-40bp 位點(diǎn)的 CREs 相互作用來轉(zhuǎn)錄激活 FGF2 表達(dá)。它還通過與位于 SDF-1 啟動(dòng)子的 -1203bp～-1196bp 的 CRE 相互作用來激活 SDF-1 表達(dá)。

圖6 在張力應(yīng)變處理下，CREB 轉(zhuǎn)錄激活 FGF2 和 SDF-1 的表達(dá)。

總之，這些結(jié)果表明，CREB 在張力刺激下增加了 SDF-1 和 FGF2 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)了 BMSCs 的遷移和成骨細(xì)胞分化。研究對(duì) CREB 調(diào)節(jié) SDF-1 和 FGF2 以促進(jìn)骨形成的發(fā)現(xiàn)揭示了 OTM 期間張力部位骨形成的潛在機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Chang M, Lin H, Fu H, Wang J, Yang Y, Wan Z, Han G. CREB activation affects mesenchymal stem cell migration and differentiation in periodontal tissues due to orthodontic force. Int J Biochem Cell Biol. 2020 Dec;129:105862. doi: 10.1016/j.biocel.2020.105862. Epub 2020 Oct 10. PMID: 33045372.

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