結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域有一條不成文的觀點：結(jié)構(gòu)決定功能。只有知道生物分子的原子排布，科學(xué)家們才能了解這個蛋白的功能。幾十年來，分析蛋白結(jié)構(gòu)有一個無冕*——X射線晶體衍射。在X射線晶體衍射中，科學(xué)家們讓蛋白結(jié)晶，然后利用X射線照射，隨后根據(jù)X射線的衍射來重建蛋白的結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行(Protein Data Bank)的100000多條蛋白詞目里，超過90%的蛋白結(jié)構(gòu)是利用X射線晶體衍射技術(shù)解析得到的。
盡管X射線晶體衍射一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)家的*工具，但是它存在較大的限制?？茖W(xué)家們將蛋白進行大塊結(jié)晶通常需要多年的時間。而很多基礎(chǔ)蛋白分子，例如嵌在細胞膜上的蛋白，或是形成復(fù)合體的蛋白卻無法被結(jié)晶。
X射線晶體衍射技術(shù)(X-ray crystallography)即將成為歷史，低溫電子顯微技術(shù)(cryo-electron microscopy, 也稱作electron cryomicroscopy, cryo-EM)引發(fā)結(jié)構(gòu)生物學(xué)變革。
低溫電子顯微鏡適用于研究大的、穩(wěn)定的分子，這些分子能夠承受電子的轟擊，而不發(fā)生變形——由多個蛋白組成的分子機器是的樣本。因此由RNA緊緊圍繞的核糖體是*的樣本。三位化學(xué)家用X射線晶體衍射研究核糖體溶液的工作在2009年獲得了諾貝爾化學(xué)獎，但這些工作花了幾十年。近幾年，低溫電鏡研究者們也陷入了“核糖體熱”。多個團隊研究了多種生物的核糖體，包括人類核糖體的*高清模型。X射線晶體衍射的研究成果遠遠落后于LMB的Venki Ramakrishnan實驗室，Venki獲得了2009年的諾獎。Venki表示，對于大分子來說，低溫電子顯微鏡遠比X射線晶體衍射要實用。
這幾年，低溫電子顯微鏡的相關(guān)文章有很多：2015年一年，這個技術(shù)就用于100多個分子的結(jié)構(gòu)研究。X-射線晶體衍射只能對單個、靜態(tài)的蛋白晶體成像，但低溫電子顯微鏡能夠?qū)Φ鞍椎亩喾N構(gòu)象進行成像，幫助科學(xué)家們推斷蛋白的功能。
現(xiàn)在低溫電鏡迅猛發(fā)展，專家們正在尋找更大的挑戰(zhàn)作為下一個解析目標(biāo)。對很多人來說，zui想解析的是夾在細胞膜內(nèi)的蛋白。這些蛋白是細胞信號通路中的關(guān)鍵分子，也是比較熱門的藥物靶標(biāo)。這些蛋白很難結(jié)晶，而低溫電子顯微鏡不大可能對單個蛋白進行成像，這是因為很難從背景噪音中提取這些信號。
這些困難都無法阻擋加利福利亞大學(xué)(University of California)的生物物理學(xué)家程亦凡。他計劃解析一種細小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是檢測辣椒中引起灼燒感的物質(zhì)的受體，并與其它痛感蛋白緊密相關(guān)。加利福利亞大學(xué)病理學(xué)家David Julius等人之前嘗試結(jié)晶TRPV1，結(jié)果失敗。用低溫電子顯微鏡解析TRPV1項目，一開始進展緩慢。但2013年底，技術(shù)進步使得這一項目有了重大突破，他們獲得了分辨率為0.34納米的TRPV1蛋白的結(jié)構(gòu)。該成果的發(fā)表對于領(lǐng)域來說，無異于驚雷。因為這證實了低溫電子顯微鏡能夠解析小的、重要的分子。
盡管低溫電子顯微鏡發(fā)展迅速，很多研究者認為，它仍有巨大提升空間。他們希望能制造出更靈敏的電子探測器，以及更好地制備蛋白樣本的方法。這樣的話，就能夠?qū)Ω〉?、更動態(tài)的分子進行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者發(fā)表了一篇細菌蛋白的結(jié)構(gòu)，分辨率達到了0.22納米。這也顯示了低溫顯微鏡的潛力。
1997年時，英國醫(yī)學(xué)研究委員會分子生物學(xué)實驗室結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Richard Henderson非常堅定地宣稱，低溫電鏡會成為解析蛋白結(jié)構(gòu)的主流工具。在將近20年后的今天，他的預(yù)測比當(dāng)年有了更多底氣。Henderson表示，如果低溫電鏡保持這樣的勢頭繼續(xù)發(fā)展，技術(shù)問題也得以解決，那么低溫電鏡不僅會成為解析蛋白結(jié)構(gòu)的*選擇，而是主流選擇。這個目標(biāo)已經(jīng)離我們不遠了。
1. 施一公小組在《Science》發(fā)兩篇論文報道剪接體三維結(jié)構(gòu)
U4/U6.U5 tri-snRNP電鏡密度及三維結(jié)構(gòu)示意圖。
2015年8月21日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院施一公教授研究組在*期刊《科學(xué)》(Science)同時在線發(fā)表了兩篇背靠背研究長文，題目分別為“3.6埃的酵母剪接體結(jié)構(gòu)”(Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 Angstrom Resolution)和“前體信使RNA剪接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)”(Structural Basis of Pre-mRNA Splicing)。*篇文章報道了通過單顆粒冷凍電子顯微技術(shù)(冷凍電鏡)解析的酵母剪接體近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)，第二篇文章在此結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進行了詳細分析，闡述了剪接體對前體信使RNA執(zhí)行剪接的基本工作機理。清華大學(xué)生命學(xué)院博士后閆創(chuàng)業(yè)、醫(yī)學(xué)院博士研究生杭婧和萬蕊雪為兩篇文章的共同*作者。
這一研究成果具有極為重大的意義。自上世紀(jì)70年代后期RNA剪接的發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家們一直在步履維艱地探索其中的分子奧秘，期待早日揭示這個復(fù)雜過程的分子機理。施一公院士研究組對剪接體近原子分辨率結(jié)構(gòu)的解析，不僅初步解答了這一基礎(chǔ)生命科學(xué)領(lǐng)域長期以來備受關(guān)注的核心問題，又為進一步揭示與剪接體相關(guān)疾病的發(fā)病機理提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。詳細新聞報道參見：施一公研究組在《科學(xué)》發(fā)表論文報道剪接體組裝過程重要復(fù)合物U4/U6.U5 tri-snRNP的三維結(jié)構(gòu)。(Science, 20 Aug 2015, doi: 10.1126/science.aac7629; doi: 10.1126/science.aac8159)
2. Science：HIV重大突破!*zui詳細HIV包膜三維結(jié)構(gòu)出爐!
這項研究解析出HIV Env三聚體處于自然狀態(tài)下的高分辨率結(jié)構(gòu)圖，其中HIV利用Env三聚體侵入宿主細胞。圖片來自The Scripps Research Institute。
在一項新的研究中，TSRI的研究人員解析出負責(zé)識別和感染宿主細胞的HIV蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)圖片。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2016年3月4日那期Science期刊上，論文標(biāo)題為“Cryo-EM structure of a native, fully glycosylated, cleaved HIV-1 envelope trimer”。
這項研究是解析出這種被稱作包膜糖蛋白三聚體(envelope glycoprotein trimer，以下稱Env三聚體)的HIV蛋白處于自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)圖。這些也包括詳細地繪制這種蛋白底部的脆弱位點圖，以及能夠中和HIV的抗體結(jié)合位點圖。(Science, 04 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2450)
3. Nature：*zui詳細轉(zhuǎn)錄因子TFIID三維結(jié)構(gòu)出爐，力助揭示人類基因表達秘密
在一項新的研究中，來自美國加州大學(xué)伯克利分校、勞倫斯伯克利國家實驗室和西班牙國家研究委員會(CSIC)羅卡索拉諾物理化學(xué)研究所的研究人員在理解我們體內(nèi)被稱作轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC)的分子機構(gòu)(molecular machinery)如何發(fā)現(xiàn)合適的DNA片段進行轉(zhuǎn)錄方面取得重大進展。他們*地詳細呈現(xiàn)一種被稱作TFIID的轉(zhuǎn)錄因子所發(fā)揮的作用。相關(guān)研究結(jié)果于2016年3月23日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Structure of promoter-bound TFIID and model of human pre-initiation complex assembly”。論文通信作者是勞倫斯伯克利國家實驗室生物物理學(xué)家Eva Nogales，論文*作者是Nogales實驗室生物物理學(xué)研究生Robert Louder。其他作者是Yuan He、José Ramón López-Blanco、Jie Fang和Pablo Chacón。
這一發(fā)現(xiàn)是非常重要的，這是因為它為科學(xué)家們理解和治療一系列惡性腫瘤鋪平道路。Eva Nogales說，“理解細胞中的這種調(diào)節(jié)過程是操縱它或當(dāng)它變壞時修復(fù)它的*方式?；虮磉_是包括從胚胎發(fā)育到癌癥在內(nèi)的很多重要生物學(xué)過程的關(guān)鍵。一旦我們能夠操縱這些基本機制，那么我們就能夠要么校正應(yīng)當(dāng)或不應(yīng)當(dāng)存在的基因表達，要么阻止這種過程[即基因表達]失去控制時的惡性狀態(tài)。”(Nature, 31 March 2016, doi:10.1038/nature17394)
4. Science：科學(xué)家成功解析人類剪接體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)
在zui近發(fā)表的一篇Science研究論文中，來自德國的科學(xué)家們利用冷凍電鏡技術(shù)在分子級分辨率水平上重現(xiàn)了人類剪接體中一個關(guān)鍵復(fù)合體——U4/U6.U5 tri-snRNP的結(jié)構(gòu)。剪接體是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的用于切掉mRNA前體中內(nèi)含子的分子機器。該研究解析的U4/U6.U5 tri-snRNP是構(gòu)成剪接體的一個重要組成部分，研究人員利用單顆粒冷凍電鏡獲得了人類U4/U6.U5 tri-snRNP的三維結(jié)構(gòu)，該復(fù)合體分子量達到180萬道爾頓，解析分辨率達到7埃。該研究模型揭示了Brr2 RNA解螺旋酶如何在分離的人類tri-snRNP中通過空間結(jié)構(gòu)阻止未成熟的U4/U6 RNA發(fā)生解鏈，還展現(xiàn)了泛素C端水解酶樣蛋白Sad1如何將Brr2固定在預(yù)激活位置。
研究人員將他們獲得的結(jié)構(gòu)模型與釀酒酵母tri-snRNP以及裂殖酵母剪接體的結(jié)構(gòu)進行了對比，結(jié)果表明Brr2在剪接體激活過程中發(fā)生了顯著的構(gòu)象變化，支架蛋白Prp8也發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化以容納剪接體的催化RNA網(wǎng)絡(luò)。(Science, 25 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2085)
5. 北京大學(xué)毛有東、歐陽頎課題組與其合作者在Science發(fā)表炎癥復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
炎癥復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)
北京大學(xué)物理學(xué)院毛有東研究員、北京大學(xué)物理學(xué)院/定量生物學(xué)中心歐陽頎院士與哈佛醫(yī)學(xué)院吳皓教授合作利用冷凍電子顯微鏡技術(shù)解析了近原子分辨率的炎癥復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)，闡釋了其復(fù)合物在免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的單向多聚活化的分子結(jié)構(gòu)機理。該研究工作以“Cryo-EM Structure of the Activated NAIP2/NLRC4 Inflammasome Reveals Nucleated Polymerization”為題于2015年10月8日在線發(fā)表在期刊Science。
先天免疫是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，炎癥復(fù)合體在觸發(fā)先天免疫響應(yīng)的過程中起到了關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)器作用，從而啟動細胞凋亡等免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。炎癥復(fù)合體是胞漿內(nèi)一組復(fù)雜的多蛋白復(fù)合體，是胱天蛋白酶活化所必需的反應(yīng)平臺，其復(fù)合物單體由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，并在上游蛋白的激活下誘導(dǎo)組裝形成環(huán)狀復(fù)合物。炎癥復(fù)合體的結(jié)構(gòu)對于認識先天免疫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、免疫調(diào)控和病原誘導(dǎo)活化等免疫響應(yīng)機理具有關(guān)鍵的核心價值，因而成為國內(nèi)外*結(jié)構(gòu)生物學(xué)和免疫學(xué)實驗室追捧的研究對象。(Science, 23 Oct 2015, 10.1126/science.aac5789)
6. Nature：施一公團隊揭示γ-分泌酶原子分辨率結(jié)構(gòu)
人體γ-分泌酶3.4埃三維結(jié)構(gòu)
日前，清華大學(xué)教授施一公團隊與國外學(xué)者合作，構(gòu)建了分辨率高達3.4埃的人體γ-分泌酶的電鏡結(jié)構(gòu)，并且基于結(jié)構(gòu)分析了γ-分泌酶致病突變體的功能，為理解γ-分泌酶的工作機制以及阿爾茨海默氏癥的發(fā)病機理提供了重要基礎(chǔ)。相關(guān)成果8月18日在《自然》發(fā)表。
阿爾茨海默氏癥是zui為嚴(yán)峻的老年神經(jīng)退行性疾病之一，但其發(fā)病機理尚待揭示。目前研究已知β-淀粉樣沉淀是該病的標(biāo)志性癥狀之一。而β-淀粉樣沉淀的產(chǎn)生是APP蛋白經(jīng)過一系列蛋白酶切割產(chǎn)生的短肽聚集而來。在此切割過程中，zui關(guān)鍵的蛋白酶是γ-分泌酶。γ-分泌酶由四個跨膜蛋白亞基組成，其中，編碼Presenilin(PS1)蛋白的基因中有200多個突變與阿爾茨海默氏癥病人相關(guān)。γ-分泌酶在阿爾茨海默氏癥的發(fā)病中扮演著重要角色。
研究人員通過收集更多的數(shù)據(jù)、大量的計算并升級分類方法，計算構(gòu)建出3.4埃原子分辨率γ-分泌酶的三維結(jié)構(gòu)，可以觀察到絕大部分氨基酸的側(cè)鏈以及胞外區(qū)部分糖基化修飾和結(jié)合的脂類分子。在高分辨結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，施一公研究組對PS1上的致病性突變體進行了研究，發(fā)現(xiàn)這些突變主要集中在兩個較為集中的區(qū)域內(nèi)。他們對于其中一些突變體進行了生化性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)這些突變會影響γ-分泌酶對于底物APP的酶切活性，然而對切割活性的影響卻有所不同。(Nature, 10 September 2015, doi:10.1038/nature14892)
7. Nature：人類核糖體結(jié)構(gòu)終于被解析!
核糖體是進行蛋白質(zhì)翻譯的機器，能夠催化蛋白質(zhì)合成。目前，許多研究已經(jīng)對多種生物的核糖體結(jié)構(gòu)進行了原子水平的結(jié)構(gòu)解析，但獲得人核糖體結(jié)構(gòu)一直存在很大挑戰(zhàn)，這一問題的解決對于人類疾病的深入了解以及治療手段和策略的開發(fā)都有重要意義。
近日，學(xué)術(shù)期刊nature在線發(fā)表了法國科學(xué)家關(guān)于人類核糖體結(jié)構(gòu)解析的研究進展。
在該項研究中，研究人員利用高分辨率單顆粒低溫電子顯微鏡以及原子模型構(gòu)建的方法獲得了人類核糖體接近原子水平的結(jié)構(gòu)。該核糖體結(jié)構(gòu)的平均分辨率為3.6A，接近zui穩(wěn)定區(qū)域的2.9A分辨率水平。這一研究成果對人類核糖體RNA，氨基酸側(cè)鏈的實體結(jié)構(gòu)，特別是轉(zhuǎn)運RNA結(jié)合位點以及tRNA脫離位點處的特定分子相互作用提供了深入見解，揭示了核糖體大小亞基接觸面的原子細節(jié)，發(fā)現(xiàn)在核糖體大小亞基的旋轉(zhuǎn)運動過程中，其接觸面發(fā)生了強烈的重構(gòu)過程。(Nature, 30 April 2015, doi:10.1038/nature14427)
8. Nature：日本科學(xué)家成功解析代謝關(guān)鍵因子受體結(jié)構(gòu)
近日，學(xué)術(shù)期刊nature在線發(fā)表了日本科學(xué)家的研究進展，他們利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法對脂聯(lián)素(adiponectin)受體，AdipoR1和AdipoR2，進行了結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體具有與G蛋白偶聯(lián)受體不同的七次跨膜螺旋，對于靶向脂聯(lián)素受體的肥胖及其相關(guān)代謝疾病治療方法開發(fā)具有重要意義。
在該項研究中，研究人員對人類AdipoR1和AdipoR2的晶體結(jié)構(gòu)進行了解析，分辨率分別達到2.9 ?和2.4 ?，他們通過解析發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體是具有不同結(jié)構(gòu)的一類新受體。脂聯(lián)素受體的這種七次跨膜螺旋在構(gòu)象上與G蛋白偶聯(lián)受體的七次跨膜螺旋不同，在這種新的 七次跨膜螺旋中，由三個保守組氨酸殘基協(xié)同一個鋅離子形成了一個大的腔體。這種鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)可能在adiponectin刺激的AMPK磷酸化和UCP2表達上調(diào)方面具有一定作用。(Nature, 16 April 2015, doi:10.1038/nature14301 )
9. Molecular Cell：中國科學(xué)家揭示A型流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體的三維冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
2015年1月22日，中科院生物物理所劉迎芳研究組與清華大學(xué)王宏偉研究組在期刊Molecular Cell雜志在線發(fā)表了題目為 “Cryo-EM Structure of Influenza Virus RNA Polymerase Complex at 4.3 ? Resolution”的論文，揭示了流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能。
生物物理所劉迎芳和清華大學(xué)王宏偉課題組等中外多方參與的實驗室通過使用的高分辨率單顆粒冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)，解析了含有A型流感病毒RNA聚合酶大部分成分的4.3埃分辨率的四聚體電鏡結(jié)構(gòu)。該復(fù)合體涵蓋了流感病毒聚合酶催化活性的核心區(qū)域。從三維重構(gòu)密度圖中可以清晰識別出該空腔內(nèi)PB1上的催化結(jié)構(gòu)域以及結(jié)合的RNA復(fù)制起始鏈，據(jù)此，研究人員推測這是進行RNA合成反應(yīng)的區(qū)域。這一活性中心結(jié)構(gòu)與正鏈RNA聚合酶具有相似性，研究人員也因此提出了流感病毒合成新生RNA鏈的機制。(Molecular Cell, 5 March 2015, doi:10.1016/j.molcel.2014.12.031)
10. Cell：科學(xué)家獲得*中介體復(fù)合物結(jié)構(gòu)圖
中介體復(fù)合物(Mediator Complex)是細胞中zui大也zui為復(fù)雜的分子機器之一。現(xiàn)在，來自斯克利普斯研究所(TSRI)的科學(xué)家們在《細胞》雜志上報告稱，他們利用用電鏡獲得了*中介體復(fù)合物(Mediator)的結(jié)構(gòu)圖。
Mediator是所有動植物細胞中的關(guān)鍵分子機器，對于絕大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄有著至關(guān)重要的調(diào)控作用。Mediator擁有二十多個蛋白亞基，解析它的結(jié)構(gòu)是基礎(chǔ)細胞生物學(xué)的一大進步。這一成果能夠為許多疾病提供寶貴的線索(從癌癥到遺傳性的發(fā)育疾病)。論文資深作者，TSRI副教授Francisco Asturias表示："明確這些大分子機器的結(jié)構(gòu)和作用機制，可以幫助我們理解許多關(guān)鍵的細胞過程。"
在這項新研究中，研究人員獲得了高純度的酵母Mediator，并通過電鏡成像得到了迄今為止zui為清晰的Mediator3D模型，分辨率達到約18埃。隨后他們又進行了多種生化分析，例如在逐個去除蛋白亞基的同時觀察電鏡圖像發(fā)生的改變。他們由此確定了酵母Mediator25個蛋白亞基的定位。
項新研究獲得的結(jié)構(gòu)圖譜，全面修正了之前的Mediator'粗略模型。論文*作者Kuang-LeiTsai表示："定位了所有的蛋白亞基之后，我們發(fā)現(xiàn)頭部模塊應(yīng)該位于Mediator的頂部而不是底部。"此外，研究人員還對人類Mediator進行了深入研究。Tsai說："大體上看，人類和酵母的Mediator總體結(jié)構(gòu)頗為類似。"zui后研究人員在結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，為人們展示了Mediator調(diào)控轉(zhuǎn)錄時的構(gòu)象變化。
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