主要用途

 細(xì)菌氫ATP酶（H^＋-ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用氫ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，在排除其它ATP酶干擾的情況下，受到氫ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進(jìn)行測算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)菌細(xì)胞H^＋-ATP酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

產(chǎn)品內(nèi)容

裂解液（Reagent A）           毫升

保存液（Reagent B）          毫升

緩沖液（Reagent C）         毫升

酶促液（Reagent D）             微升

反應(yīng)液（Reagent E）             毫升

底物液（Reagent F）           毫升

陰性液（Reagent G）            毫升

產(chǎn)品說明書                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

恒溫?fù)u床：用于細(xì)菌培養(yǎng)

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

9． 置于冰槽里30分鐘，期間強(qiáng)力渦旋震蕩15秒三次

10． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）

11． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

12． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心去掉上清液 

14． 加入xx微升保存液（Reagent B），混勻

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 

二、測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如純化細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對照測定

1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升酶促液（Reagent D）

3．加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4．加入xx微升底物液（Reagent F）

5．放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6．加入xx微升陰性液（Reagent G）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

四、樣品活性測定

1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升酶促液（Reagent D）

3．加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4．加入xx微升底物液（Reagent F）

5．放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6．加入50微升待測樣品（注意：50微克膜蛋白；樣品須溶解）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

五、計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

1．本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照測定

2．操作時，須戴手套

3．系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4．建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5．加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測定

6．反應(yīng)測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)30分鐘

7．測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性

8．光譜測定后，比色皿須清洗充分

9．建議待測樣本膜蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

10．樣品特異活性是指排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）等ATP酶的干擾后的氫ATP酶活性

11．氫ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

12．本公司提供系列ATP酶類分析技術(shù)產(chǎn)品 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確