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主要用途
細(xì)胞蛋白磷酸化酶2A(PP2A)活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用特異性合成底物磷酸化多肽,在PP2A去磷酸化后,釋放出游離磷酸根,由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后峰值的變化,采用比色法測(cè)定其峰值的變化,以此進(jìn)行測(cè)算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞裂解懸液樣品包括免疫沉淀復(fù)合物和粗提或部分純化酶樣品的蛋白磷酸化酶2A活性及其抑制劑的檢測(cè)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶,嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,反應(yīng)優(yōu)化,檢測(cè)敏感。
保存方式
保存裂解液(Reagent B)、緩沖液(Reagent C)、反應(yīng)液(Reagent E)、顯色液(Reagent F)和專性液(Reagent H)在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融;其余的保存在4℃冰箱里;顯色液(Reagent F)具有腐蝕性,避免直接用手接觸; 有效保證6月
用戶自備
15毫升離心管:用于樣品處理的容器
1.5毫升離心管:用于樣品處理和保存的容器
細(xì)胞刮脫棒:用于貼壁細(xì)胞脫離
(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品收集
培養(yǎng)箱:用于孵育反應(yīng)物
500微升1厘米光徑比色皿:用于比色的容器
分光光度儀:用于比色分
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞(5 X 107細(xì)胞)
2. 小心加入3毫升預(yù)冷的清理液(Reagent A),覆蓋生長(zhǎng)表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞
5. 加入3毫升清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
6. 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開始)
7. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入500微升裂解液(Reagent B),充分混勻
10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11. 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12. 置于冰槽里孵育30分鐘
13. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14. 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15. 移取2微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定(注意:建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1)
16. 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測(cè)定準(zhǔn)
1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如細(xì)胞裂解萃取液等),置于冰槽里(注意:樣品須澄清)
2. 設(shè)定好分光光度儀(溫度為37℃):波長(zhǎng)為660nm,并置零
3. 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管,標(biāo)記為1至5號(hào)管
4. 按下表分別加入陰性液(Reagent D)和標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent G)到每個(gè)離心管,混勻
5. 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用,避免光照;標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
1. 移取200微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿
2. 在30℃溫度下孵育20分鐘
3. 加入200微升顯色液(Reagent F),混勻
4. 在37℃溫度下孵育10分鐘,避免光照
5. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè):獲得吸光讀數(shù)
6. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次
7. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為吸光單位(A);橫座標(biāo)(X軸)為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度(微摩爾/升)
四、 (選擇步驟)樣品背景測(cè)定
1. 移取120微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入20微升待測(cè)樣品(總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白)
3. 在30℃溫度下孵育20分鐘
4. 加入60微升陰性液(Reagent D),混勻
5. 加入200微升顯色液(Reagent F),混勻
6. 在37℃溫度下孵育10分鐘,避免光照
7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè):獲得吸光讀數(shù)
8. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度(微摩爾/升
五、 樣品總活性測(cè)定
1. 移取100微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入20微升待測(cè)樣品(總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白)
3. 在30℃溫度下孵育2分鐘
4. 加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)
5. 在30℃溫度下孵育20分鐘
6. 加入60微升陰性液(Reagent D),混勻
7. 加入200微升顯色液(Reagent F),混勻
8. 在37℃溫度下孵育10分鐘,避免光照
9. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè):獲得吸光讀數(shù)
10. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對(duì)應(yīng)磷濃度(微摩爾/升)
六、 樣品非特異性活性測(cè)定
1. 移取90微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入10微升專性液(Reagent H)
3. 加入20微升待測(cè)樣品(總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白)
4. 在30℃溫度下孵育5分鐘
5. 加入20微升反應(yīng)液(Reagent E)
6. 在30℃溫度下孵育20分鐘
7. 加入60微升陰性液(Reagent D),混勻
8. 加入200微升顯色液(Reagent F),混勻
9. 在37℃溫度下孵育10分鐘,避免光照
10. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè):獲得吸光讀數(shù)
11. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品非特異活性對(duì)應(yīng)磷濃度(微摩爾/升)
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