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關(guān)鍵詞:免疫沉淀技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介:世界*品牌免疫沉淀技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,質(zhì)量保證,*。
免疫沉淀技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果。
產(chǎn)品品牌:
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>材料
1, 蛋白A 或蛋白G
2, 一抗
3, 免疫沉淀緩沖液:20 mM 磷酸鈉, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脫氧膽酸鈉 and 0.02% *.
(> NOTE: 50 mM 醋酸鈉緩沖液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%* 也可作為免疫沉淀的緩沖液,能提高蛋白G的結(jié)合功效)
4, 洗脫液:0.1 M 甘氨酸-HCl buffer, pH 2.5
5, SDS-PAGE 上樣緩沖液 (pH 6.8): 2% SDS, 62.5 mM Tris 堿, 10% 甘油, 2-5%
實驗流程為:
1.用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。
2.將每毫升細胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中,在微量離心機上4℃以zui大速度離心15 min。
3.收集上清(約30 ml)并加入30μg的適當(dāng)抗體,4℃搖動免疫沉淀物1 h。
4.加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液,4℃搖動免疫沉淀物30 min。
5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重復(fù)洗5次。zui后,用NETN洗一次。
6.吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,煮沸4 min。
7.將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中,在10 mA的恒定電流下電泳。
8.通過考馬斯藍染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。
9.從膠上切下目標(biāo)帶,將其放到微量離心管中,用1ml 50%乙腈洗兩次,每次3 min。
10. 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì),再將肽電洗脫。
11. 通過窄孔液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。
在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結(jié)果的真實性,應(yīng)注意以下幾點:
(1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生;
(2) 要確??贵w的特異性,即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀;
(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的,這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。
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