人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基

重慶市華雅干細胞技術有限公司的干細胞研究產(chǎn)品主要包括：生長因子、通路調(diào)控因子、干細胞培養(yǎng)基、細胞株等，并且在倉庫備有人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基現(xiàn)貨。歡迎新老客戶：   

    Human MSC medium (Chemically-Defined) 人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基間充質(zhì)干細胞具有光明的臨床治療前景。然而，常用培養(yǎng)基含有胎牛血清（FBS），增加了病原體、異種抗原、批間不穩(wěn)定性。美國FDA正考慮禁止使用FBS于細胞治療。提供的Human MSC medium ( Chemically-Defined )，是一種無血清、無異種蛋白、化學成分明確的人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，且無需昂貴的鋪板蛋白，生長分化更優(yōu)于血清培養(yǎng)基。
    該培養(yǎng)基是為擴增從骨髓、臍帶血或脂肪組織提取的人類間充質(zhì)干細胞而設計的無血清培養(yǎng)基。它化學成分明確，所有組分為化學合成或重組純化的蛋白。它無異源蛋白，不含直接從任何動物組織提取成份。因此它不存在批間誤差和潛在的動物源性病原體。如果配合使用特定的培養(yǎng)板，還可以省去鋪板的工序和時間，免去鋪板膠的費用。
本產(chǎn)品組成及保存Human MSC medium (Chemically-Defined)（ 人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基貨號MGro-500）
產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品組成           規(guī)格      儲存                     保質(zhì)期      
 
基礎液           450ml        2 ‐ 8°C, 避光保存      6個月

添加物            50ml       ‐ 80°C, 避光保存        6個月
 

重慶市華雅干細胞技術有限公公司還可以提供：其它所需試劑：
? L‐谷氨酸鹽（L‐Glutamine),或同類產(chǎn)品；
? 選擇不鋪板：建議使用BD公司的培養(yǎng)板或 Corning公司的培養(yǎng)板
? 選擇鋪板：Fibronectin或同類產(chǎn)品；
? 胰酶Trypsin 0.05%/0.53mM EDTA或同類產(chǎn)品；
培養(yǎng)基配制：
1.解凍添加物。建議2‐8°C解凍。解凍后的溶液可以分裝，于‐80°C保存，盡量避免反復凍融。
2.配制100ml人間充質(zhì)干細胞*培養(yǎng)基，需在無菌條件下添加10ml添加物于90ml基礎液中，再加入1ml 200mM L‐谷氨酸鹽；
3.如果需要也可加入抗菌素（自選）。
    配制好的*培養(yǎng)液（包含基礎液、補充液、谷氨酸鹽）2‐8°C避光保存，保存期為1個月。從其它培養(yǎng)基向本產(chǎn)品逐漸培養(yǎng)于其它無血清或有血清培養(yǎng)基的MSCs可以快捷方便地轉換到該產(chǎn)品培養(yǎng)。多數(shù)情況下，直接轉換便可。個別情況下，可能需要逐步轉換，如20%, 40%,依次遞增。
復蘇hMSCs細胞：
1.37°C水浴快速復蘇凍融細胞。
2.將細胞轉移到50ml離心管中。
3.逐滴向裝有1ml細胞液的離心管中加入10ml預先復溫的人間充質(zhì)干細胞*培養(yǎng)基，注意邊加邊輕輕晃動離心管。
4.將上述混合溶液轉移到細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中?；蛘呖?50xg（～1200rpm）離心10min，再用*培養(yǎng)基重懸后再轉移到細胞培養(yǎng)板中。
5.在4-6%CO2，36‐38°C培養(yǎng)箱孵化。
6.孵化24h，換一次培養(yǎng)液。
7.此后每隔2天換一次液，直到傳代培養(yǎng)。
傳代培養(yǎng)：
    當使用特定的細胞培養(yǎng)板，如BD PrimariaTM系列或corning CellBINDTM系列時，使用該培養(yǎng)基是不需要預先鋪板。傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板正在評估中。對于那些還沒有被評估的產(chǎn)品或不適用于不預先鋪板工序的產(chǎn)品，推薦使用Fibronectin進行鋪板。
1.在鏡下觀察細胞，確定傳代的時間。為了保證MSCs的生長潛力，推薦在細胞量達到70%滿的時候傳代。如果細胞量達到80%以上滿時，細胞在傳代之后可能出現(xiàn)停止增殖的現(xiàn)象。切記，在任何情況下，不要讓細胞超出80%滿！
2.預先將0.05%胰酶和*培養(yǎng)基復溫到37°C待用。
3.用移液槍吸走舊培養(yǎng)基。
4.用DPBS洗一遍（自選）。
5.加入0.05%胰酶以覆蓋住細胞表面，推薦室溫消化細胞（消化液用量：6孔板每一孔約10cm2加入0.5ml，25cm2培養(yǎng)板加入1ml）。
6.鏡下觀察細胞，當看見細胞開始從培養(yǎng)板剝離，輕輕敲擊培養(yǎng)板邊緣幫助細胞脫落。消化時間為1‐3分鐘。注意，消化時間會比在有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞要短。當所有細胞都脫落時，快速采取以下步驟。（不要在所有細胞都脫落后，保持在胰酶中太長時間，因為這樣會影響MSCs以后的生長狀態(tài)）。
7.加入2倍于消化液的*培養(yǎng)基，將細胞懸液收集于15ml離心管中。（如果是使用胰酶消化細胞，可以使用大豆酶抑制劑來終止胰酶。尤其是當以下步驟8洗細胞不能在10分鐘內(nèi)被完成的情況下，這一步是非常必要的。原因是這類無血清培養(yǎng)基中都不含抗胰蛋白酶。除非快速離心分離，否則培養(yǎng)基中留存的胰蛋白酶會破壞細胞并影響其生長能力。）
8.1200rpm離心10分鐘。
9.盡量棄去離心后的上層清液。用*培養(yǎng)基重懸細胞。此時可取細胞懸液進行細胞計數(shù)。
10.按照3~5X103細胞量/cm2接種細胞。上下左右輕輕搖勻細胞以保證細胞在培養(yǎng)板里的均勻分布。細胞接種密度：6孔板每一孔約10cm2約3~5X104細胞，25cm2培養(yǎng)板約0.75~1.25X105細胞。
11.4~6%CO2，37°C培養(yǎng)。
12.每隔2天換新鮮的*培養(yǎng)基。
13.當細胞量達到70%滿時，傳代（一般每隔3-4天）。
凍存細胞:
1.配制細胞凍存液：90%*培養(yǎng)液 + 10%DMSO。
2.離心分離細胞，用凍存液重懸細胞，使細胞密度為1~5x106/ml，轉移到凍存管中。
3.將凍存管轉移到凍存盒中，依次置于4度-負20度- 負80度冰箱。
4.將細胞轉移到液氮罐中長期貯存。
僅供研究研究使用，不用于人的診斷及治療。

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