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細胞培養(yǎng)基的基本知識
閱讀：1644發(fā)布時間：2016-5-20
細胞培養(yǎng)基的基本知識
培養(yǎng)細胞的*培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基（如MEM）和添加劑（如血清或無血清培養(yǎng)用的某些確定的激素及生長因子）組成，培養(yǎng)基的配方一直在改進，其中包括抗生素和抗有絲分裂劑等等。
一、基礎培養(yǎng)基 絕大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養(yǎng)物質。zui廣泛應用的培養(yǎng)基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸，維生素的范圍亦很廣，另外常規(guī)含有無機鹽和代謝添加劑（例如核苷酸）。MEM/F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2，形成神經(jīng)生物學zui通用的培養(yǎng)基。Dulbecco`s改良培養(yǎng)基——DMEM，現(xiàn)應用于快速生長的細胞，同MEM含有相同的營養(yǎng)成分，但濃度高出2~4倍。選擇某種培養(yǎng)基，應仔細了解成分表，應知道大多數(shù)情形下培養(yǎng)基都有不足。例如，有些培養(yǎng)基在氨基酸中包括有谷氨酸，而這種培養(yǎng)基雖廣泛用于神經(jīng)生物學領域，但它對某些對谷氨酸敏感的可能有細胞外毒性損傷的神經(jīng)元而言，則并非*選擇，特別是如果神經(jīng)元生長在缺乏膠質的環(huán)境中時。F12中含有硫酸亞鐵，據(jù)報道也有神經(jīng)毒效應。
在所有這些培養(yǎng)基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度，這是因為它具有不穩(wěn)定性以及在許多細胞培養(yǎng)中它常用作碳源。對于神經(jīng)元的培養(yǎng)常常在基礎培養(yǎng)基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培養(yǎng)基中這兩種物質缺乏時）。MEM與F12均要用5%的CO2來平衡，DMEM含更高濃度的NaCO3，要用10%的CO2來平衡，當然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎培養(yǎng)基的組成成分是建立在對不同細胞系生長的研究之上的，但通常在原代培養(yǎng)中使用也能有比較令人滿意的結果。 原則上，HEPES作為緩沖劑可用來代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制。實際操作中并非如此簡單。顯然，溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長是重要的。Leiboviz`s L15培養(yǎng)基可用來在大氣環(huán)境中令神經(jīng)細胞生長，該培養(yǎng)基采用了與眾不同的BSS作基礎，它含有高濃度的氨基酸來提高緩沖能力，培養(yǎng)基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養(yǎng)基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產生。這一培養(yǎng)基的優(yōu)點是明顯的，特別是在保持較高CO2有困難時，例如在長時間的顯微操作及生理學研究中。L15培養(yǎng)基已用來成功的培養(yǎng)了外周神經(jīng)元，但尚未在CNS神經(jīng)元的發(fā)育研究中全面檢測過。
二、血清 細胞在單純的基礎培養(yǎng)基中不能存活，在特殊類型的細胞培養(yǎng)中必須提供某些痕量營養(yǎng)物質及生長因子才能使細胞得以生長并維持生長狀態(tài)?；A培養(yǎng)基常常要添加血清，血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來源須用經(jīng)驗確定，廣泛應用的血清種類有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子，常選其作增殖細胞用的血清，也用于細胞系和原代培養(yǎng)。而馬血清常常用來作有絲分裂后的神經(jīng)元培養(yǎng)。然而，很多人也將胎牛血清用于神經(jīng)元培養(yǎng)，也有人用馬血清來培養(yǎng)膠質細胞。用大鼠進行神經(jīng)元培養(yǎng)的某些研究者喜歡使用同型血清；人類的胎盤血清，亦曾用于神經(jīng)組織的器官類型的培養(yǎng)，也用在一些特殊培養(yǎng)種類中。 血清的不同批號含有不同的成分，所以許多人發(fā)現(xiàn)，應該在使用前對血清進行測試。大多數(shù)試劑商提供樣品，所滿意的批號即可選用，這樣可以一次得到足夠一年用量的血清，血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。
三、無血清培養(yǎng)基 1979年神經(jīng)細胞培養(yǎng)出現(xiàn)了一個重要進展，用化學添加劑即可維持神經(jīng)細胞存活與生長而不需要在培養(yǎng)基中添加血清。其工作基礎是用合適的激素、營養(yǎng)物和促貼壁的物質的組合置換培養(yǎng)基中的成分，zui后找到了適合大多數(shù)細胞培養(yǎng)的試劑配方，該配方稱為N2，專門用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)，zui早是用在B104大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系的培養(yǎng)。它的基礎培養(yǎng)基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數(shù)類型細胞的存活和生長有重要作用，硒是谷胱甘肽產生的合作因子，可能有助于過氧化物和超氧化物的水解，有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉鐵蛋白。 未料到的是上述配方構成的培養(yǎng)基可以支持神經(jīng)母細胞瘤細胞系快速增殖，隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基在許多實驗室里已取代了有血清培養(yǎng)。在某些培養(yǎng)方案中，細胞直接進入無血清培養(yǎng)，這樣的培養(yǎng)基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經(jīng)元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。于神經(jīng)元的培養(yǎng)基在某些培養(yǎng)環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細胞的增殖，故可使神經(jīng)元純化。 血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。當缺乏這些成分時，如神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中生長時，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進低密度培養(yǎng)細胞的存活。有學者發(fā)現(xiàn)細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而，無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時變小，特別是神經(jīng)元與膠質共培養(yǎng)時，它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質如谷氨酸。 應該注意，盡管無血清培養(yǎng)基是有化學限定性的，但在培養(yǎng)過程中它仍有變動，培養(yǎng)起始時可能有些物質缺乏，而后細胞的產物可能積累，從而使培養(yǎng)基的成分改變。這其實是有另一方面的好處，即條件培養(yǎng)基（已培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)基）的形成，條件培養(yǎng)基常常用來增加神經(jīng)元和膠質細胞的發(fā)育。
培養(yǎng)細胞的*培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基（如MEM）和添加劑（如血清或無血清培養(yǎng)用的某些確定的激素及生長因子）組成，培養(yǎng)基的配方一直在改進，其中包括抗生素和抗有絲分裂劑等等。
一、基礎培養(yǎng)基 絕大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養(yǎng)物質。zui廣泛應用的培養(yǎng)基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸，維生素的范圍亦很廣，另外常規(guī)含有無機鹽和代謝添加劑（例如核苷酸）。MEM/F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2，形成神經(jīng)生物學zui通用的培養(yǎng)基。Dulbecco`s改良培養(yǎng)基——DMEM，現(xiàn)應用于快速生長的細胞，同MEM含有相同的營養(yǎng)成分，但濃度高出2~4倍。選擇某種培養(yǎng)基，應仔細了解成分表，應知道大多數(shù)情形下培養(yǎng)基都有不足。例如，有些培養(yǎng)基在氨基酸中包括有谷氨酸，而這種培養(yǎng)基雖廣泛用于神經(jīng)生物學領域，但它對某些對谷氨酸敏感的可能有細胞外毒性損傷的神經(jīng)元而言，則并非*選擇，特別是如果神經(jīng)元生長在缺乏膠質的環(huán)境中時。F12中含有硫酸亞鐵，據(jù)報道也有神經(jīng)毒效應。
在所有這些培養(yǎng)基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度，這是因為它具有不穩(wěn)定性以及在許多細胞培養(yǎng)中它常用作碳源。對于神經(jīng)元的培養(yǎng)常常在基礎培養(yǎng)基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培養(yǎng)基中這兩種物質缺乏時）。MEM與F12均要用5%的CO2來平衡，DMEM含更高濃度的NaCO3，要用10%的CO2來平衡，當然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎培養(yǎng)基的組成成分是建立在對不同細胞系生長的研究之上的，但通常在原代培養(yǎng)中使用也能有比較令人滿意的結果。 原則上，HEPES作為緩沖劑可用來代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制。實際操作中并非如此簡單。顯然，溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長是重要的。Leiboviz`s L15培養(yǎng)基可用來在大氣環(huán)境中令神經(jīng)細胞生長，該培養(yǎng)基采用了與眾不同的BSS作基礎，它含有高濃度的氨基酸來提高緩沖能力，培養(yǎng)基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養(yǎng)基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產生。這一培養(yǎng)基的優(yōu)點是明顯的，特別是在保持較高CO2有困難時，例如在長時間的顯微操作及生理學研究中。L15培養(yǎng)基已用來成功的培養(yǎng)了外周神經(jīng)元，但尚未在CNS神經(jīng)元的發(fā)育研究中全面檢測過。
二、血清 細胞在單純的基礎培養(yǎng)基中不能存活，在特殊類型的細胞培養(yǎng)中必須提供某些痕量營養(yǎng)物質及生長因子才能使細胞得以生長并維持生長狀態(tài)?；A培養(yǎng)基常常要添加血清，血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來源須用經(jīng)驗確定，廣泛應用的血清種類有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子，常選其作增殖細胞用的血清，也用于細胞系和原代培養(yǎng)。而馬血清常常用來作有絲分裂后的神經(jīng)元培養(yǎng)。然而，很多人也將胎牛血清用于神經(jīng)元培養(yǎng)，也有人用馬血清來培養(yǎng)膠質細胞。用大鼠進行神經(jīng)元培養(yǎng)的某些研究者喜歡使用同型血清；人類的胎盤血清，亦曾用于神經(jīng)組織的器官類型的培養(yǎng)，也用在一些特殊培養(yǎng)種類中。 血清的不同批號含有不同的成分，所以許多人發(fā)現(xiàn)，應該在使用前對血清進行測試。大多數(shù)試劑商提供樣品，所滿意的批號即可選用，這樣可以一次得到足夠一年用量的血清，血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。
三、無血清培養(yǎng)基 1979年神經(jīng)細胞培養(yǎng)出現(xiàn)了一個重要進展，用化學添加劑即可維持神經(jīng)細胞存活與生長而不需要在培養(yǎng)基中添加血清。其工作基礎是用合適的激素、營養(yǎng)物和促貼壁的物質的組合置換培養(yǎng)基中的成分，zui后找到了適合大多數(shù)細胞培養(yǎng)的試劑配方，該配方稱為N2，專門用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)，zui早是用在B104大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系的培養(yǎng)。它的基礎培養(yǎng)基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數(shù)類型細胞的存活和生長有重要作用，硒是谷胱甘肽產生的合作因子，可能有助于過氧化物和超氧化物的水解，有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉鐵蛋白。 未料到的是上述配方構成的培養(yǎng)基可以支持神經(jīng)母細胞瘤細胞系快速增殖，隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基在許多實驗室里已取代了有血清培養(yǎng)。在某些培養(yǎng)方案中，細胞直接進入無血清培養(yǎng)，這樣的培養(yǎng)基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經(jīng)元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。于神經(jīng)元的培養(yǎng)基在某些培養(yǎng)環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細胞的增殖，故可使神經(jīng)元純化。 血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。當缺乏這些成分時，如神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中生長時，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進低密度培養(yǎng)細胞的存活。有學者發(fā)現(xiàn)細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而，無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時變小，特別是神經(jīng)元與膠質共培養(yǎng)時，它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質如谷氨酸。 應該注意，盡管無血清培養(yǎng)基是有化學限定性的，但在培養(yǎng)過程中它仍有變動，培養(yǎng)起始時可能有些物質缺乏，而后細胞的產物可能積累，從而使培養(yǎng)基的成分改變。這其實是有另一方面的好處，即條件培養(yǎng)基（已培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)基）的形成，條件培養(yǎng)基常常用來增加神經(jīng)元和膠質細胞的發(fā)育。
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