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常用的融合蛋白分為哪幾類的呢
閱讀：4903發(fā)布時間：2015-6-5
常用的融合蛋白從分子量和用途上來分，一般可分為如下三類：
1. 小分子量的融合肽：這類標簽蛋白只有幾個氨基酸，如poly His，StrepII-tag，F(xiàn)LAG，c-myc-等，主要用于靶蛋白的純化，也可用于靶蛋白的輔助檢測，且由于分子量很小，幾乎不干涉靶蛋白的結(jié)構(gòu)，活性和功能，一般純化后不用去除標簽，非常簡單方便。目前zui常使用的是poly His標簽蛋白，可使用金屬離子親和層析(IMAC)進行純化，用梯度濃度咪唑溶液洗脫。當靶蛋白為包涵體時，也可在變性條件下純化靶蛋白，容易實現(xiàn)規(guī)?；?，是目前應用的方法。但是該方法也有自身的局限性，由于許多蛋白有內(nèi)在的組氨酸和/或半胱氨酸氨基酸殘基，其它的非特異蛋白與靶蛋白一起與金屬離子親和層析柱料發(fā)生結(jié)合，影響靶蛋白的純度；另外，咪唑可能會影響晶體學，NMR等實驗；咪唑也會導致一些蛋白質(zhì)的聚集；由于金屬離子可吸附到NTA樹脂上，帶金屬離子中心的蛋白質(zhì)也不適合用該方法純化，另外Ni2+-NTA可被還原，在厭氧條件下也不適合使用該方法。
1. 小分子量的融合肽：這類標簽蛋白只有幾個氨基酸，如poly His，StrepII-tag，F(xiàn)LAG，c-myc-等，主要用于靶蛋白的純化，也可用于靶蛋白的輔助檢測，且由于分子量很小，幾乎不干涉靶蛋白的結(jié)構(gòu)，活性和功能，一般純化后不用去除標簽，非常簡單方便。目前zui常使用的是poly His標簽蛋白，可使用金屬離子親和層析(IMAC)進行純化，用梯度濃度咪唑溶液洗脫。當靶蛋白為包涵體時，也可在變性條件下純化靶蛋白，容易實現(xiàn)規(guī)?；?，是目前應用的方法。但是該方法也有自身的局限性，由于許多蛋白有內(nèi)在的組氨酸和/或半胱氨酸氨基酸殘基，其它的非特異蛋白與靶蛋白一起與金屬離子親和層析柱料發(fā)生結(jié)合，影響靶蛋白的純度；另外，咪唑可能會影響晶體學，NMR等實驗；咪唑也會導致一些蛋白質(zhì)的聚集；由于金屬離子可吸附到NTA樹脂上，帶金屬離子中心的蛋白質(zhì)也不適合用該方法純化，另外Ni2+-NTA可被還原，在厭氧條件下也不適合使用該方法。
Strep-tagII，只有8個氨基酸(色氨酸-絲氨酸-組氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-谷氨酸-賴氨酸)的小標簽，該標簽與固定在以Sepharose為基礎(chǔ)的基質(zhì)上的Strep-Tactin 配基特異性結(jié)合，并且Strep-tagII與Strep-Tactin的結(jié)合親和力比鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合親和力多大約100倍，使得StrepTactin Sepharose 高性能適合純化Strep-tag II蛋白，得到的靶蛋白純度更高。純化均在生理條件下進行，使用脫硫生物素溫和的洗脫很好地保護了靶蛋白的活性。Strep-tag II的*性能被越來越多的科研者認識并應用。
2. 大分子量增溶性融合蛋白：如GST (谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶), MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白），SUMO（泛素樣修飾蛋白），NusA（轉(zhuǎn)錄終止抗終止因子），TrxA（大腸桿菌硫氧還蛋白），DsbA（蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶）等，這類融合蛋白的主要功能是提高靶蛋白的可溶性，促進靶蛋白正確折疊，提高穩(wěn)定性。其中GST標簽蛋白可直接利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione sepharose)親和樹脂進行純化，MBP融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。其他幾個融合蛋白則不能直接純化，蛋白融合構(gòu)建時需要和用于純化的小標簽聯(lián)用，如在靶蛋白N端融合His-SUMO的方式。但是由于這些融合蛋白的分子量比較大，容易影響到靶蛋白的構(gòu)象和功能，因此純化后需要切除，通常的方式是在融合蛋白和靶蛋白之間加入蛋白酶（一般有腸激酶，TEV，凝血酶，Xa因子）識別特異序列，切割后經(jīng)過親和層析，去除標簽蛋白部分，得到靶蛋白，但會在靶蛋白N端殘留2-3個氨基酸，一般不會影響靶蛋白的結(jié)構(gòu)和活性，但有些蛋白的活性對N端的外源氨基酸很敏感，甚至多出一個外源氨基酸都會影響到蛋白的活性。
需要重點指出SUMO作為融合蛋白的一個重要優(yōu)點，即SUMO蛋白酶特異地識別完整的SUMO標簽蛋白序列，*移除SUMO標簽蛋白，不會殘留外源氨基酸。SUMO蛋白酶在較寬范圍的反應環(huán)境體系中保持較高的活力，例如溫度（4～30℃）、pH（5.5～9.5）等。SUMO蛋白酶帶有多聚His標簽，融合蛋白切割后可進行親和層析純化，去除SUMO蛋白酶，得到天然的目的蛋白。針對SUMO的這一優(yōu)勢，目前科研人員對SUMO進行改造，提高其穩(wěn)定性，開發(fā)了一系列SUMO融合表達產(chǎn)品，分別針對原核表達系統(tǒng)，酵母表達系統(tǒng)，昆蟲表達系統(tǒng)和哺乳動物表達系統(tǒng)的表達載體和SUMO蛋白酶等，被越來越廣泛的應用。
3. 報告性融合蛋白：這類融合蛋白常用的有eGFP（增強型綠色熒光蛋白），eCFP（增強型青色熒光蛋白）和eYFP（增強型黃色熒光蛋白）等熒光蛋白，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變而來，熒光強度更強、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。融合這些熒光蛋白，可進行目標基因的活細胞檢測，這些熒光蛋白自發(fā)熒光，無需使用抗體或原位雜交等技術(shù)，無需破碎組織細胞，直接通過熒光顯微鏡就可在活細胞狀態(tài)下實時觀察目的基因在細胞中的亞細胞定位和表達情況，可謂活細胞探針。如果兩個蛋白分別融合不同熒光蛋白，通過FRET原理，還可進行活體細胞中蛋白互作的研究。熒光蛋白作為標簽蛋白，還有以下優(yōu)勢：自發(fā)熒光，不用破碎組織細胞，觀察目的基因的實時定位和表達情況；熒光性質(zhì)穩(wěn)定，不受細胞內(nèi)其他產(chǎn)物的干擾；消耗低，檢測快速簡便，靈敏度高且重現(xiàn)性好，非常適合高通量的藥物篩選。目前這些熒光蛋白已經(jīng)被廣泛應用于基團表達調(diào)控、轉(zhuǎn)基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等。
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