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臍血中分離干細胞-改良HES分離法
閱讀：2602發(fā)布時間：2015-4-22
臍帶血干細胞改良HES分離法是將傳統(tǒng)的HES分離法進行優(yōu)化和改進，在后期給予氯化銨將紅細胞液的體積縮減與分離。詳細的操作步驟如下:
1.確保操作時在無菌的環(huán)境下進行，因而需要準備超凈臺對穿刺部位進行消毒；
2.然后將6%的HES分別按照臍血血量的1/4加入到采集來的血袋中；
3.混合均勻后使用無菌封口膠密封穿刺點，倒置與10℃的低溫環(huán)境中靜置6小時；
4.分離好后先將臍血下層的紅細胞緩慢的放出，取50ml離心管置于其中，然后將血漿放入另一只50ml離心管中；
5.把盛有紅細胞的離心管，室溫、600r/min、離心5分鐘，把上層的血漿部分吸出后置于另一只盛有血漿的50ml離心管中，將剩下的紅細胞丟棄即可；
6.把收集血漿的離心管，室溫、600r/min、離心5分鐘，取上清部分保留在50ml離心管中，將下層紅細胞去除；
7.將上步中收集的上清液室溫、1200r/min、離心10分鐘，去1ml上層血清作為備用，將其他上清去除，將含有核細胞下層部分濃縮至約5ml，用PBS 將體積調(diào)整至25ml；
8.重復上步操作3次，將zui終得到的細胞用PBS調(diào)整體積支5ml；
9.將得到的有核細胞液與氯化銨破紅細胞液(NH4CL)按照1:1的比例進行混合，室溫、800r/min、離心10分鐘，棄上清所有的下層細胞用PBS反復清洗3次，重懸細胞于上述步驟7作為備用上清液，然后將體積調(diào)整至1000μl；
10.用微量移液器吸取包細胞稀釋液0.49ml轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，加入10μl細胞懸液混勻后，在低倍鏡下計算池四角的四個大方格的有核細胞數(shù)，將其總數(shù)×125 , 即得到1μl 懸液內(nèi)的有核細胞數(shù)；
11.用微量移液器去0.49mlPBS液移至EP管中，加入有核細胞懸液10μl混合均勻后加入0.5的臺盼藍染液100μl再將其混合均勻后等待2分鐘，制片鏡檢計數(shù)；
12.取NC混懸液50ul用流式細胞儀檢測人源性CD34 +細胞的含量，具體的方法如下:
(1)在上機試管底部加入50μl 樣品；
(2)加入單克隆抗體CD34-PE10ul混勻；
(3)避光室溫孵育20分鐘，加入500μl 紅細胞裂解液充分混勻；
(4)室溫靜置20分鐘后加入PBS也500μl充分混勻；
(5)上機檢測。
13.去10ul的有核細胞懸液進行需氧菌、厭氧菌和霉菌培養(yǎng)，需氧性與厭氧性雜菌培養(yǎng)均采用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，霉菌與腐生菌培養(yǎng)均采用改良馬丁培養(yǎng)基，然后將其分別置于30-35攝氏度和20-25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，后觀察結(jié)果即可。
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