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ELISA包括哪些實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)
ELISA實(shí)驗(yàn)步驟
圖3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1. 樣本采集：
a) 血漿：采集血漿時(shí)可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血?jiǎng)?。采集?0分鐘內(nèi)，1000xg離心15分鐘。立即檢測(cè)或分裝后于≤-20℃儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
b) 細(xì)胞培養(yǎng)上清液：通過離心去除顆粒，立即檢測(cè)或分裝后將樣品于≤-20°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
c) 細(xì)胞裂解液：在裂解緩沖液中裂解細(xì)胞并將其放在冰上靜置30分鐘。14,000xg離心5分鐘除去不溶物。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中利用總蛋白分析法定量總蛋白濃度。立即檢測(cè)或分裝后將樣品于≤-20°C儲(chǔ)存。
d) 乏血小板血漿：在采集血漿時(shí)可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血?jiǎng)?。采集?0分鐘內(nèi)，1000xg離心15分鐘。建議在2-8°C下，10,000xg 再次離心10分鐘，以便全去除血小板。立即檢測(cè)或分裝后于≤-20°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
e) 血清：使用不含抗凝劑的收集管，讓樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘，然后1000xg離心15分鐘。立即取出血清并進(jìn)行檢測(cè)或分裝后于≤-20°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
f) 唾液：將唾液收集到管中，10,00xg離心5分鐘。收集水相，立即檢測(cè)或分裝后將樣品于≤-20°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
g) 尿液：無菌進(jìn)行當(dāng)天shou次尿液的采集(中段尿)，直接排入無菌容器中。離心去除不溶顆粒物質(zhì)。立即檢測(cè)或分裝后于≤-20°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
h) 母乳：2-8°C，1000xg 離心15分鐘。重復(fù)進(jìn)行水相部分的收集，總共3次。立即檢測(cè)。
i) 組織勻漿液：制備方法因組織類型而異。用1XPBS緩沖液沖洗以除去多余血液，使用20mL 1XPBS進(jìn)行勻漿，并于≤-20°C下儲(chǔ)存過夜。將勻漿液凍融兩次以便破壞細(xì)胞膜，然后5000xg離心5分鐘。去除上清液后立即進(jìn)行檢測(cè)，或者分裝后于≤-20°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
j) 組織裂解液：用PBS沖洗組織，將組織切成1-2mm的薄片，用組織勻漿器在PBS中進(jìn)行勻漿。加入等體積的含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液，在室溫下裂解組織30分鐘，裂解過程中輕搖裂解液。離心去除沉淀。利用總蛋白質(zhì)分析法定量總蛋白的濃度。立即檢測(cè)或分裝后于≤-20°C儲(chǔ)存。
2. 預(yù)實(shí)驗(yàn)
ELISA實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)是非常有必要的，一方面為了檢測(cè)試劑盒是否好用，標(biāo)曲擬合線性是否良好，最高OD值是否能達(dá)到2.0左右，是否存在假陽性假陰性；另外一方面為了檢測(cè)樣本最佳稀釋比例，樣本濃度過高要進(jìn)行稀釋；樣本濃度過低要選擇超敏試劑盒。
3. ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)照
a) 空白對(duì)照：提供背景信號(hào)參考，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度。
b) 陽性對(duì)照：已知含有目標(biāo)蛋白的內(nèi)源性可溶樣品，或已知含有檢測(cè)抗體免疫原的純化蛋白或多肽來作為陽性對(duì)照。當(dāng)樣品的檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，陽性對(duì)照的陽性結(jié)果可表明實(shí)驗(yàn)過程無誤且有效，所以實(shí)驗(yàn)的陰性結(jié)果是真實(shí)的。
c) 陰性對(duì)照：已知不表達(dá)目標(biāo)蛋白的樣品。其有助于檢測(cè)非特異性結(jié)合和假陽性結(jié)果。
d) 標(biāo)準(zhǔn)品：含有已知濃度的目標(biāo)蛋白的樣品，可從中獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
e) 樣本基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)品（加標(biāo)對(duì)照品）：加標(biāo)對(duì)照可用來給出有關(guān)某種特殊樣品基質(zhì)中分析物發(fā)現(xiàn)程度的信息，從而表明檢測(cè)性能。比如，在 ELISA 中檢測(cè)血清樣品時(shí)，按照慣例標(biāo)準(zhǔn)品用正常稀釋緩沖液來稀釋。但可以同時(shí)用檢測(cè)的種屬血清來稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
4.實(shí)驗(yàn)步驟（以Human IL-6 ELISA Kit – Quantikine，Catalog # D6050）
1. 使用前將所有試劑和樣品置于室溫。建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品一式兩份；
2.用不完的微孔板條可以移除，將它們放回含有干燥劑包裝的箔袋中，并重新密封；
3. 每孔加入100 μL檢測(cè)稀釋劑RD1W；
4. 每孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品或樣品，蓋上蓋子。室溫孵育2小時(shí)。同時(shí)做好板布局的記錄；
5. 棄去液體，使用400 μL洗滌緩沖液洗滌，重復(fù)三次，共洗滌四次。有條件的話可以使用自動(dòng)洗板機(jī)，最后一次洗滌的時(shí)候，去除掉所有洗滌緩沖液后，把孔板倒置，用干凈的吸水紙吸干；
6. 每孔加人IL-6檢測(cè)抗體200 μL。蓋上蓋子，室溫孵育2小時(shí)；
7. 重復(fù)步驟5中的洗滌；
8. 每孔加底物溶液200 μL，室溫下孵育20分鐘，避光；
9. 每孔加入50 μL反應(yīng)停止液。并且能夠觀察到孔里的顏色從藍(lán)色變成黃色。如果孔內(nèi)顏色呈綠色或顏色變化不均勻，輕拍板以確保充分混合；
10. 在30分鐘內(nèi)測(cè)定每個(gè)孔的吸光度，設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450nm。如果有波長(zhǎng)校正，請(qǐng)?jiān)O(shè)置為540nm或570nm。如果波長(zhǎng)校正不可用，可以用450nm讀數(shù)減去540nm或570nm讀數(shù)。
ELISA操作小技巧
圖4 ELISA操作小技巧（圖源于R&D）
ELISA常見問題
| 常見問題 | 原因 | 解決方法 |
| 無信號(hào)或信號(hào)低，但標(biāo)準(zhǔn)曲線正常 | 樣本中無目標(biāo)分子 或目標(biāo)分子濃度低于試劑盒檢測(cè)范圍 | 更換可以檢測(cè)濃度更低的試劑盒 或?qū)颖具M(jìn)行濃縮 |
| 樣本中的基質(zhì)效應(yīng)干擾了目標(biāo)蛋白與抗體結(jié)合 | 用適當(dāng)?shù)南♂屢簩?duì)樣本進(jìn)行濃縮梯度處理，檢測(cè)稀釋的線性度是否良好，設(shè)置加標(biāo)對(duì)照品 | |
| 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都無信號(hào)或信號(hào)低 | 標(biāo)準(zhǔn)品問題 標(biāo)準(zhǔn)品毀壞（樣品孔有信號(hào)） 標(biāo)準(zhǔn)品重溶方法是否正確 | 重新使用一瓶新的標(biāo)準(zhǔn)品 待標(biāo)準(zhǔn)品恢復(fù)室溫后，按照說明書加入提及的稀釋液，充分溶解15分鐘 |
| 顯色試劑是否有效 顯色時(shí)間不充足 | 進(jìn)行color test 增加顯色時(shí)間 | |
| 實(shí)驗(yàn)條件與操作問題 | 孵育溫度，時(shí)間，是否需要振蕩器，酶標(biāo)儀是否設(shè)置正確等 | |
| 信號(hào)強(qiáng) | 樣本中檢測(cè)分子的濃度高，超出試劑盒檢測(cè)范圍 | 對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?/span> |
| 洗滌不充分，殘留有未結(jié)合的過氧化物酶 | 按照說明書進(jìn)行充分洗滌（洗板機(jī)，增加洗滌次數(shù)） | |
| 板孔有干掉的情況 | 洗滌和加樣的過程中速度要快一些 | |
| 顯色液、終止液未及時(shí)使用 | 顯色液、終止液盡量現(xiàn)配現(xiàn)用 | |
| CV值高或者重復(fù)性差 | 洗板不規(guī)范導(dǎo)致washing buffer殘留，使后加的反應(yīng)試劑濃度不穩(wěn)定 | 洗滌步驟嚴(yán)格按照說明書操作 |
| 顯色試劑不穩(wěn)定 各板孔的抗體不穩(wěn)定，不均一 | 盡量選擇質(zhì)量有保障的試劑盒 | |
| 實(shí)驗(yàn)溫度問題 | 保持溫度適當(dāng)且無明顯變化 | |
| 實(shí)驗(yàn)操作問題 | 嚴(yán)格要求操作細(xì)節(jié) |
文中部分相關(guān)產(chǎn)品
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 特點(diǎn) |
| Picus 電動(dòng)移液器 | 735461 | 12通道， 10-300 µl |
| Tacta手動(dòng)移液器 | LH-729230 | 12通道， 5–100 µl |
| 數(shù)顯旋渦振蕩器 | VM-D | 超大可調(diào)量程300-4200rpm，適用于各種強(qiáng)度混合 |
| PE VICTOR NivoTM 酶標(biāo)儀 | NIVOF | 32位濾光片轉(zhuǎn)輪，可在不同波長(zhǎng)條件下執(zhí)行檢測(cè)，滿足所有實(shí)驗(yàn) |
| 酶標(biāo)板震蕩器 | 3208025 | 可震蕩2塊或4塊酶標(biāo)板 |
| arium® mini plus純水超純水一體機(jī) | H2O-MA-T | 同時(shí)產(chǎn)出Type3級(jí)反滲透純水和Type1級(jí)超純水 |
參考資料：Bio-techne ELISA技術(shù)指南
上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司
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