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背景部分介紹：

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種骨髓(BM)漿細(xì)胞(PCs)的腫瘤，其分泌單克隆免疫球蛋白，誘導(dǎo)多器官損傷。MM主要發(fā)生在老年人中，前兆階段包括兩種類型，一種稱為意義不明的單克隆γ病(MGUS)；另一種是MGUS向MM進展的一個過渡階段，稱為陰燃型多發(fā)性骨髓瘤(SMM)。了解從前驅(qū)疾病發(fā)展為臨床活動性MM的機制可能有助于對特定人群實施早期治療。

遺傳異質(zhì)性是MM的一個標(biāo)志。免疫球蛋白編碼基因的染色體易位和高二倍體被認(rèn)為是早期遺傳事件，隨后是NF-κB、MAPK-RAS和凋亡通路的異常，從而促進wan全惡性MM表型。晚期遺傳改變通常涉及MYC和TP53基因，這些基因在復(fù)發(fā)/難治性MM中通常發(fā)生改變。根據(jù)遺傳特征，多發(fā)性骨髓瘤被分為不同的風(fēng)險組，表現(xiàn)出不同的標(biāo)準(zhǔn)治療結(jié)果。在這種情況下，原發(fā)性遺傳病變的獲得順序，以及它們?nèi)绾未龠MMM從前體狀態(tài)進展，尚未wan全闡明。除了遺傳學(xué)，越來越多的證據(jù)表明，腫瘤PCs的存活在很大程度上取決于它們所在的骨髓造血細(xì)胞生態(tài)位的相互作用。因此，腫瘤抑制微環(huán)境提供了有效的監(jiān)測，以限制MGUS和SMM階段的PC生長，而進行性免疫編輯導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭是MM轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。然而，在進展過程中，遺傳多樣性的腫瘤細(xì)胞與基底細(xì)胞微環(huán)境相互作用以逃避免疫監(jiān)視的機制在很大程度上是未知的。

解決這些科學(xué)問題具有臨床意義，因為盡管MM的生存率不斷提高，但治愈仍然難以捉摸，大多數(shù)MM患者最終會復(fù)發(fā)。單克隆抗體免疫治療新策略，T細(xì)胞接合劑和嵌合抗原受體T細(xì)胞療法有望更長期地控制MM，這可能最終導(dǎo)致治愈。然而，這種治療效果與MM患者對免疫檢查點抑制劑的低應(yīng)答率形成鮮明對比。迫切需要破解不同免疫治療方法差異結(jié)果背后的機制。然而，由于缺乏能夠概括MM的主要臨床、遺傳和免疫學(xué)特征的實驗小鼠模型，這項研究受到了嚴(yán)重的阻礙。在這種情況下，在小鼠中產(chǎn)生MM的主要障礙是不確定疾病的起源細(xì)胞和啟動和維持轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵遺傳驅(qū)動因素。缺乏小鼠MM模型限制了臨床前免疫治療研究，這構(gòu)成了當(dāng)前未滿足的醫(yī)療需求。

在這里，作者介紹了15種基因工程小鼠模型，這些模型反映了該疾病發(fā)病機制的關(guān)鍵因素：遺傳異質(zhì)性，MGUS和SMM狀態(tài)向臨床活動性疾病的進展轉(zhuǎn)變，以及腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)化過程中與BM免疫微環(huán)境的相互作用。研究結(jié)果表明，MYC是遺傳異質(zhì)性MM腫瘤和免疫進展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它決定了免疫治療的臨床反應(yīng)。

主要結(jié)果總結(jié)：

●對多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)重要驅(qū)動因子進行小鼠模型的建立

●通過轉(zhuǎn)錄組分析揭示疾病進展的SMUG、SMM、MM時期相關(guān)性及具有疾病促進作用重要基因MYC的功能

●MAPK-MYC軸對MM的調(diào)控

●MM進展過程中發(fā)生了BM微環(huán)境重塑（T cell，NK cell浸潤）

●MM的遺傳異質(zhì)性導(dǎo)致對ICB治療響應(yīng)的不同

●提出CD8+T/Treg，作為檢測及評估治療的生物標(biāo)志物

結(jié)果具體介紹：

1.小鼠多發(fā)性骨髓瘤的遺傳異質(zhì)性建模

為了建立遺傳多樣性MM的臨床前模型，將攜帶8種MM遺傳驅(qū)動因子的轉(zhuǎn)基因小鼠培育成具有單、雙和三重遺傳改變的工程菌株，這些基因驅(qū)動因子概括了人類MM中最常見的變，其中包括通過IKBKB/IKK2表達激活NF-κB信號，KRASG12D突變，抗凋亡BCL2表達，c-MYC表達，TP53缺失，以及分別模擬免疫球蛋白易位t(11;14)， t(16;14)和t(4;14)的cyclin D1, c-MAF和MMSET/NSD2的組成性表達。用綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫幼鼠，然后監(jiān)測小鼠12個月大時MM的發(fā)育情況a。其中3個系顯示BM中wan全滲透的PC腫瘤，這縮短了中位總生存期(mOS)至12個月以下，其中兩種小鼠系被命名為MImb1和MIcγ1，因為它們分別通過mb1-cre或cγ1-cre等位基因表達MYC和IKK2NF-κB，第三個小鼠系被命名為BIcγ1，因為它通過cγ1-cre等位基因表達了BCL2和IKK2NF-κB b。3種不同細(xì)胞系的BM腫瘤由>10% GFP+CD138+B220?sIgM?PCs組成，形態(tài)與人MM細(xì)胞相似，在BM內(nèi)呈多灶浸潤模式;它們也表達典型的MM標(biāo)記，包括酸性磷酸酶、Bcma、Slamf7和Taci，分泌免疫球蛋白到血清中，并表現(xiàn)出克隆性IghV基因重排c-f。然而，雖然BIcγ1和MIcγ1菌株主要分泌IgG或IgA，但來自未成熟前b細(xì)胞的MImb1小鼠出現(xiàn)IgM分泌表型g。

為了構(gòu)建MM遺傳異質(zhì)性，將BIcγ1和MIcγ1小鼠與攜帶其他MM遺傳變化的種系雜交，這些遺傳異常均縮短了BIcγ1和MIcγ1小鼠的MM發(fā)育時間，誘導(dǎo)了一種由GFP+CD138+B220- sIgM- PCs組成的BM疾病，分泌IgG或IgA，并被歸類為MM h-i。接下來，確定小鼠模型是否會像人類一樣，在出現(xiàn)MM癥狀之前就存在前體疾病。在BIcγ1和其衍生的小鼠中，形成致命MM前，在6個月大的時候均經(jīng)過了MGUS樣階段，其特征是很少有寡克隆GFP+CD138+B220- sIgM- PCs浸潤的BM，這些細(xì)胞適度地向血清中分泌類型轉(zhuǎn)換的免疫球蛋白k-l。

2. 小鼠多發(fā)性骨髓瘤的轉(zhuǎn)錄和基因組分析

為了確定正常BM PC的共同轉(zhuǎn)錄特征，對模型小鼠的MGUS和MM期細(xì)胞進行RNA-seq， PC基因包括(Prdm1、Irf4、Xbp1、Sdc1編碼Cd138、Tnfrsf17編碼Bcma、Tnfrsf13b編碼Taci和Slamf7)的上調(diào)和B細(xì)胞基因的下調(diào)a。為了比較小鼠腫瘤與人類疾病，將RNA-seq應(yīng)用于新診斷的MGUS和MM患者的惡性PCs，以確定與正常BM PCs相比的轉(zhuǎn)錄特征。利用主成分分析(PCA)，發(fā)現(xiàn)小鼠和人類MGUS細(xì)胞定位在PC和MM之間，這表明它們具有相似的進化轉(zhuǎn)錄軌跡b。對比發(fā)現(xiàn)，BIcγ1來源的小鼠表現(xiàn)出線性的轉(zhuǎn)錄進化，從BM細(xì)胞到MGUS細(xì)胞再到MM細(xì)胞，與晚期進展一致。而MIcγ1小鼠的MGUS和MM細(xì)胞緊密聚集，差異表達基因數(shù)量減少，與快速進展一致c。比較兩種模型發(fā)現(xiàn)，MYC在MM期表達較高，但在BIcγ1小鼠的MGUS期表達卻相對很低d。MM轉(zhuǎn)錄組的GSEA發(fā)現(xiàn)“MYC靶基因"在兩種模型中都是最重要的標(biāo)志e。因此，MYC蛋白表達在原代骨髓MM細(xì)胞和從原代骨髓樣本建立的MM衍生細(xì)胞系中，包括早期和晚期進展者f。這些結(jié)果表明，在BIcγ1模型中，內(nèi)源性MYC表達在MM進展過程中獲得，而MIcγ1小鼠中轉(zhuǎn)基因MYC的早期激活加速了MM進展。同樣，在患者中，MYC在MGUS細(xì)胞中的表達水平與BM PCs相似，而在MM細(xì)胞中表達水平升高，這與先前的研究一致，證實了MYC調(diào)節(jié)進展為MM的時間加快g。

小鼠MM細(xì)胞的遺傳特征顯示核型為三倍體、四倍體或復(fù)雜的非整倍體，并伴有反復(fù)的染色體獲得和損失以及結(jié)構(gòu)重排h-i。其中包括62例MM原代樣品中的11例(18%)和6例MM衍生細(xì)胞系中的3例(50%)MYC與Igh或Igl基因之間的類似人類易位j。然后，作者評估了MYC在遺傳多樣性MM衍生細(xì)胞系中的致癌功能。用小分子MYCi975選擇性靶向MYC誘導(dǎo)劑量依賴性MYC蛋白還原30,31，從而降低小鼠和人MM細(xì)胞的活力k。

3. MAPK-MYC軸指示多發(fā)性骨髓瘤的進展

通過全外顯子組測序(WES)對腫瘤突變負(fù)荷(TMB)進行量化，62只小鼠中有29只（47%）在MM期觀察到MAPK通路基因突變；這些比率與MM患者中觀察到的相似，這表明該信號級聯(lián)的突變在MM進展過程中積累a。早期和晚期MM細(xì)胞模型的基因組特征分析顯示，MIcγ1小鼠的核型正常，沒有MYC易位，而Trp53缺失的BIcγ1小鼠與未缺失Trp53的小鼠相比，染色體異常更豐富，TMB更高，表明TP53驅(qū)動的遺傳不穩(wěn)定性促進了MM進展過程中的遺傳重排b。接下來，對比獲得性MAPK突變在小鼠和人類MM中是否類似。western blot分析發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人mm來源的細(xì)胞系中，蛋白激酶ERK (MAPK激活的替代物)的磷酸化一致c。曲美替尼(MEK-ERK inhibitor),逆轉(zhuǎn)ERK磷酸化，降低小鼠和人MM細(xì)胞的生長，這表明共享MAPK激活d-e。鑒于在小鼠MM發(fā)育過程中獲得了MAPK通路突變和MYC激活，研究MAPK信號是否可以調(diào)節(jié)MYC的表達是必要的。發(fā)現(xiàn)盡管曲美替尼在RNA水平上并沒有持續(xù)改變MYC基因的表達，但MEK抑制降低了MYC Ser62位點的磷酸化，從而誘導(dǎo)了劑量依賴性MYC降解f。

4. 多發(fā)性骨髓瘤進展的免疫特征

為了從模型中獲得進一步的見解，通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)測定了不同基因型小鼠在順序疾病階段的BM免疫微環(huán)境的順序變化。在進展過程中觀察到T淋巴細(xì)胞和NK數(shù)量的線性增加，這與PC擴增相關(guān)a-b。由于在不同小鼠品系的BM微環(huán)境中觀察到廣泛的T細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤，我們根據(jù)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的豐度對MM病例進行了劃分（low，high）c。42%MM病例表現(xiàn)出與健康小鼠骨髓微環(huán)境相似的免疫細(xì)胞浸潤，58%病例表現(xiàn)出更豐富的淋巴樣細(xì)胞，主要是表型耗竭的CD8+ T淋巴細(xì)胞d。此外，浸潤high組病例含有更多的免疫抑制性CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞，CD8+ T淋巴細(xì)胞的負(fù)荷與Treg細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)，這表明T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和免疫抑制狀態(tài)在小鼠MM發(fā)育過程中相互作用d。

為了探索與人類疾病的相似之處，對病人相關(guān)樣本進行了相同的檢測，結(jié)果與小鼠模型一致e-h。接下來，作者研究了這些類別是否與小鼠和患者的MM生物學(xué)和臨床特征相關(guān)。免疫浸潤細(xì)胞數(shù)量較多的病例血清中單克隆免疫球蛋白水平較高，作為MM細(xì)胞負(fù)荷增加的替代指標(biāo)i。此外，骨髓免疫表型與年齡相關(guān)，骨髓浸潤T、NK淋巴細(xì)胞的數(shù)量與年齡呈負(fù)相關(guān)j。然而，在小鼠模型和人類中，腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞浸潤的分布在MM遺傳亞群中是相似的，包括標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險和高風(fēng)險類別k。

5. 多發(fā)性骨髓瘤MM的免疫治療響應(yīng)

為了檢測小鼠模型的早期和晚期MM進展是否會影響對免疫治療的反應(yīng)，特別是對免疫檢查點阻斷(ICB)治療的反應(yīng)，對MIcγ1小鼠進行抗pd -1治療，從MGUS期開始，持續(xù)8周，發(fā)現(xiàn)顯著降了低腫瘤負(fù)荷，延遲了MM的發(fā)展a。相反BIcγ1小鼠在治療中沒有引起反應(yīng)b?？筎IGIT單克隆抗體的類似治療策略在兩種小鼠模型中均未產(chǎn)生治療效果a-b。研究了前驅(qū)期BM微環(huán)境的組成是否會對免疫檢查點治療產(chǎn)生調(diào)節(jié)反應(yīng)。MIcγ1小鼠表現(xiàn)出更高的活化PD-1+、TIGIT+和LAG3+ CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量較BIcγ1小鼠，但免疫抑制CD4+PD-1+ Treg細(xì)胞數(shù)量也較低c-d。CD8+ T細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例在MIcγ1小鼠中較高e。為了探討患者體內(nèi)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和免疫抑制T細(xì)胞之間的平衡，我們對69例未接受治療的SMM患者的BM進行了流式細(xì)胞術(shù)分析。發(fā)現(xiàn)CD8+ T/Treg比值高的與比值低的患者相比，進展為活動性MM的時間更短(PFS: median progression-free survival) f-g，表明SMM的快速進展是通過腫瘤細(xì)胞阻斷PD-1+CD8+ T淋巴細(xì)胞而發(fā)生的，而與Treg細(xì)胞無關(guān)，這表明具有高風(fēng)險進展的SMM患者可能受益于抗PD-1治療。接下來，在新診斷的170例臨床活動性MM患者中研究BM CD8+ T/Treg比值，14%表現(xiàn)出更高T細(xì)胞比率與MIcγ1小鼠相似， 86%低比率患者與BIcγ1小鼠相似h，那度胺和地塞米松治療后，發(fā)現(xiàn)比值高的患者早期復(fù)發(fā)率高i。這些發(fā)現(xiàn)表明，從前體階段發(fā)展到MM的時間塑造了BM免疫微環(huán)境，這反過來影響了臨床免疫治療的結(jié)果。

6. 調(diào)節(jié)CD8+T/Treg比值提高免疫治療效果

為了探索TME中T細(xì)胞亞群之間的功能相互作用，對小鼠和患者的MGUS期、MM期、健康對照 的BM CD3+ T淋巴cell進行了 scRNA-seq和TCR-seq a。在MIcγ1和BIcγ1小鼠中，CD8+ T細(xì)胞在MM期同樣表達了耗竭/激活標(biāo)記(Pdcd1、Tigit、Lag3)和細(xì)胞毒性標(biāo)記(Ifng、Gzma、Gzmb、Gzmk)，但在MGUS期中幾乎檢測不到這些標(biāo)記，Treg細(xì)胞也表達激活、免疫抑制狀態(tài)的標(biāo)記物，包括Tigit、Ctl4、Cxcr3、Tnfrsf9（編碼Cd137）、Icos和Tnfrsf4（OX40）b。有趣的是，這種Treg細(xì)胞活化的表型在MGUS樣品中已經(jīng)很明顯，并且在兩種模型小鼠的MM階段保持不變c。scRNA-seq和TCR-seq數(shù)據(jù)表明，在小鼠模型和患者MGUS期，CD8+ T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了頻繁的克隆型TCR序列（紫色與黃色重疊），但Treg沒有d。

接下來，探討破壞T細(xì)胞毒性和免疫抑制之間的平衡是否會影響對ICB的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)CD8+ T細(xì)胞的耗竭明顯加速MM的發(fā)病，而體內(nèi)Treg細(xì)胞的耗竭則相反，提示CD8+ T細(xì)胞和Treg細(xì)胞在MM細(xì)胞的調(diào)控中起作用e-f。通過TIGIT抑制緩解CD8+ T細(xì)胞衰竭導(dǎo)致對PD-1和PD-L1阻斷的反應(yīng)，實現(xiàn)持久的MM反應(yīng)g。此外，用CD25單克隆抗體消耗Treg細(xì)胞延長了小鼠的生存期，并增強了抗PD-1和抗PD-L1治療的療效h?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)強化了骨髓CD8+ T/Treg細(xì)胞比例預(yù)測ICB反應(yīng)性的概念，并為優(yōu)化臨床MM免疫治療提供了潛在的生物標(biāo)志物。

本文研究意義：

建立了多發(fā)性骨髓瘤的異質(zhì)性模型，為疾病的治療研究提供便利

提出了CD8+ T/Treg比值，作為檢測及評估治療的生物標(biāo)志物

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