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【細(xì)胞治療】——高分文獻與應(yīng)用多維分析

閱讀：965 發(fā)布時間：2022-7-28

引言

腫瘤發(fā)病率和死亡率持續(xù)增高造成了嚴(yán)重的社會負(fù)擔(dān)，驅(qū)動著腫瘤治療的重要手段之一的CAR-T，TCR-T等細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展。
細(xì)胞治療是利用來自患者或供體的活細(xì)胞來代替受損或患病的細(xì)胞，或刺激身體的免疫反應(yīng)或再生的治療，通常使用的是干細(xì)胞與免疫細(xì)胞。
本期將分別從基因、蛋白、細(xì)胞、組織四個層面展開，對細(xì)胞治療領(lǐng)域前沿技術(shù)與文獻進行解析和分享。

#1 基因?qū)用?/span>

單細(xì)胞測序技術(shù)在細(xì)胞治療中的應(yīng)用
01 干細(xì)胞治療
通過干細(xì)胞分離、體外培養(yǎng)、定向誘導(dǎo)、甚至基因修飾等過程，在體外繁育出全新的、正常的甚至更年輕的細(xì)胞、組織或器官，并最終通過細(xì)胞組織或器官的一致實現(xiàn)對臨床疾病的治療。
干細(xì)胞種類多，按發(fā)育潛能和階段可以分為不同類型。不同條件會誘導(dǎo)出不同類型、不同干性的干細(xì)胞；通過單細(xì)胞測序技術(shù)，分析細(xì)胞轉(zhuǎn)錄及蛋白特征，可以準(zhǔn)確了解干細(xì)胞的表型，也可聯(lián)合臨床結(jié)果做關(guān)聯(lián)性分析。

· 樣本類型：健康人&AML（急性髓系白血?。┗颊吖撬?/span>
· 前期準(zhǔn)備：流式富集，將CD34陽性造血干細(xì)胞、CD34陰性細(xì)胞、CD3陽性T細(xì)胞混樣測序
· 細(xì)胞分型：通過轉(zhuǎn)錄組+蛋白組學(xué)的研究，將骨髓內(nèi)的干細(xì)胞分為了56個亞群

·Focus在CD34陽性的造血干細(xì)胞
進行以下分析：

1. 擬時序分析HSC發(fā)育狀態(tài)。

2.通過Abseq定義新的HSC發(fā)育Marker。

3.通過對HSC的Abseq結(jié)果進行算法分析，最終用12個Marker高精確度地鑒定14個CD34陽性亞群。

單細(xì)胞測序的優(yōu)勢特點在于，通量更高，可達上萬個基因的維度分析。

02 CAR-T細(xì)胞治療
CAR-T細(xì)胞治療工作流程

單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)用節(jié)點：
研發(fā)質(zhì)控階段——分析T細(xì)胞發(fā)生了哪些變化，細(xì)胞狀態(tài)、克隆型、生物學(xué)特征、臨床關(guān)聯(lián)等。

（1）在CAR-T治療臨床前應(yīng)用

（2）在CAR-T臨床研究中的應(yīng)用

單細(xì)胞測序優(yōu)勢：
在傳統(tǒng)技術(shù)上進行更加透徹的分析：大細(xì)胞通量的條件下，進行全基因組+蛋白組，高緯度地分析每一個單細(xì)胞特征，包括：基因表達、富集功能、特異性Marker、聚類分群、異質(zhì)性等。

03 TIL、TCR治療
（1）TIL治療機制研究

通過單細(xì)胞RNA測序發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合過繼性療法IL8R1+cluster細(xì)胞比例更高：IL8R1+cluster中高表達IL7R。

（2）腫瘤特異性TCR研究

（間接研究antigen-TCR）

發(fā)現(xiàn)黑色素瘤抗原特異性CD4+T亞群，并研究其phenotype及功能。

（直接研究antigen-TCR）
抗原特異性CD8+T細(xì)胞表型分析
CD8+T細(xì)胞：抗原-TCR paire分析

全基因組光學(xué)圖譜技術(shù)（OMG）在細(xì)胞治療中的應(yīng)用
01 文獻解析
AML和MDS患者中，DEK-NUP214融合是重現(xiàn)性的異常，預(yù)后不良。該融合在髓系血液腫瘤中比例較低（~0.7-2%）.傳統(tǒng)核型G顯帶不容易檢出t(6;9),尤其是低分辨率的骨髓染色體。加拿大大學(xué)健康醫(yī)學(xué)聯(lián)盟在今年2月報道了AML患者中t(6;14;9)三重易位，據(jù)了解，這是first通過細(xì)胞遺傳學(xué)檢出的AML患者中t(6;14;9)三重易位。

t(6;9)的其他易位形式報道案例較少，2例涉及DEK-NUP214融合事件被報道。一例是核型檢出t（1;9）, 轉(zhuǎn)錄組檢出DEK-NUP214融合。另一例是細(xì)胞遺傳學(xué)檢出t(9;12)(q34;q15)且隱匿性插入在6號染色體上，也是通過RNA seq檢出DEK-NUP214融合。由于6p和9q遠端片段交換或隱匿性插入較難觀察到，導(dǎo)致難以確定是否存在DEK-NUP214融合。將高分辨率SV檢測技術(shù)OGM納入常規(guī)臨床檢測有助于檢出罕見的隱匿性的細(xì)胞遺傳學(xué)異常。

該患者為一位32歲男性，圖（A）核型G顯帶初始檢測結(jié)果為18個細(xì)胞add(6)(p21),add(9)(q34),add(14)(q22)，2個細(xì)胞核型正常?；诤诵徒Y(jié)果6號和9號染色體易位斷裂點位于DEK和NUP214基因所在的區(qū)帶，序貫進行DEK和NUP214的FISH探針檢測，圖（B）顯示在衍生6號染色體上觀察到DEK和NUP214融合信號，隨后依據(jù)FISH驗證結(jié)果將核型結(jié)果修正為t(6;14;9)(p22;q22;q34).

隨后進行了OGM檢測，circos plot圈圖（C）顯示斷裂點該患者樣本檢出位于6p22.3,9q34.12,14q22.1的三重易位，且線形圖（D）顯示DEK-NUP214融合基因。DEK-NUP214融合基因預(yù)后不良，該患者經(jīng)誘導(dǎo)治療，鞏固治療后接受了同種異基因造血干細(xì)胞移植。

OGM可一次實驗檢出和明確涉及DEK-NUP214融合的t(6;14;9)三重易位，該團隊建議將OGM納入臨床實驗室常規(guī)檢測流程，用于檢出白血病中與預(yù)后和治療相關(guān)的異常。

· Bionano Saphyr系統(tǒng)以100kbp-Mbp級別讀長可實現(xiàn)超高靈敏度的結(jié)構(gòu)變異檢測分析和復(fù)雜基因組de novo組裝。

在結(jié)構(gòu)變異檢測領(lǐng)域目前廣泛應(yīng)用于腫瘤、白血病、遺傳病、罕見病等疾病的研究。相比傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)變異檢測工具，如核型、FISH，Saphyr 擁有優(yōu)秀的分辨率、全基因組覆蓋度，便捷的操作流程以及直觀的結(jié)果呈現(xiàn)，對結(jié)構(gòu)變異領(lǐng)域的難點平衡易位和倒位，可準(zhǔn)確檢出。在基因組de novo組裝領(lǐng)域，Saphyr 幫助生物學(xué)家極大提高scaffold，提升組裝質(zhì)量和完整性。

Saphyr 半導(dǎo)體芯片上有多達120,000個納米通道，經(jīng)高清CCD對所有納米通道的DNA實時成像，每個flowcell可采集高達5T數(shù)據(jù)，軟件自動將圖片數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成分子數(shù)據(jù)，最終組裝得到全基因組光學(xué)圖譜。

#2 蛋白層面

MSD第三代電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)在細(xì)胞治療中的應(yīng)用
01 應(yīng)用總覽

· 在接受CAR-T細(xì)胞治療前，評估病人免疫狀況，（Cytokinesis，CRP，Inflammation）。
· 評估細(xì)胞因子狀況，是否被激活，有效性（IFN-γ）。
· 監(jiān)測免疫系統(tǒng)的狀態(tài)
· 監(jiān)控免疫進程，免疫有效性，副反應(yīng)發(fā)生，評估免疫原性，毒性。

免疫治療相關(guān)熱門靶點：CTLA-4,Granzyme A,Granzyme B,LAG3,vWF，PD1，PDL-2，推薦使用MSD R-plex試劑盒進行開發(fā)驗證實驗，目前可以提供超過260種抗體對可供選擇，應(yīng)用涵蓋：癌癥、免疫、心血管、神經(jīng)、代謝、疫苗等。

02 應(yīng)用案例
(1)同濟醫(yī)院采用MSD進行CAR-T細(xì)胞治療臨床效果的關(guān)聯(lián)性分析

IL-8，IL1β，IFN-γ升高，代表患者感染，需采取不同的治療方案

結(jié)論：使用CAR-T細(xì)胞治療后，若患者發(fā)熱，則可通過分析以上因子的分泌情況，區(qū)分患者感染與CRS

（2）Kite 制藥，使用MSD監(jiān)測CRS

發(fā)現(xiàn)使用MSD技術(shù)相較于Luminex更加簡便，且有嚴(yán)格的Validation。

（3）紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心

（4）eurofins歐陸集團

(5)中檢院
《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)控研究要點》建議采用MSD方法進行藥效學(xué)檢測、免疫毒性檢測。

（6）諾華制藥：
上市的細(xì)胞治療藥物免疫原性評價時，使用MSD進行檢測

（7）Juno在細(xì)胞治療研發(fā)階段使用到MSD
采用基因編輯的方法，敲除PD1，進行免疫水平評估，探究是否能夠提高CAR-T細(xì)胞治療效果。結(jié)果表明：CAR-T細(xì)胞免疫原性明顯增強。

(8)使用CAR-T成功治愈患者的學(xué)者Carl H.June，以及腫瘤免疫治療先*Steven A Rosenberg也采用MSD方法進行細(xì)胞免疫學(xué)研究。

03 MSD在CRS（細(xì)胞因子風(fēng)暴）監(jiān)測應(yīng)用的優(yōu)勢特點
CRS監(jiān)測需借助靈敏度高、動態(tài)范圍廣、有嚴(yán)格法規(guī)驗證的平臺。這凸顯了MSD技術(shù)的極大優(yōu)勢：

（1）4-5 log超寬檢測范圍，fg/ml的檢測極限，多個產(chǎn)品類型選擇

（2）經(jīng)過嚴(yán)格的Validation的V-plex試劑盒

· CRS監(jiān)測應(yīng)用案例
Kite ，NCI，Juno等使用MSD試劑盒監(jiān)測CAR-T細(xì)胞治療的細(xì)胞因子風(fēng)暴

· 免疫原性金標(biāo)準(zhǔn)
獲FDA，EMEA等法規(guī)推薦，經(jīng)過大量臨床實驗使用和CRO驗證，符合GLP要求。

MSD技術(shù)流程概覽

#3 細(xì)胞層面

Lonza核電轉(zhuǎn)儀在細(xì)胞治療中的應(yīng)用

自體T細(xì)胞免疫療法其中一個關(guān)鍵痛點是GMP病毒載體（慢病毒和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒）的安全性、漫長的生產(chǎn)周期和高額的費用。

解決這個問題的一個辦法是利用非病毒轉(zhuǎn)染方法對細(xì)胞進行基因修飾。該研究和開發(fā)進展迅速，但關(guān)鍵瓶頸在于擴大制造規(guī)模以滿足商業(yè)需求。

Lonza的4D-Nucleofector™LV 單元采用電穿孔技術(shù)，可實現(xiàn)自動化、可擴展多種細(xì)胞類型和應(yīng)用的非病毒轉(zhuǎn)染方案。

以新鮮/冷凍的PBMC作為起始，4D-Nucleofector ™轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入平臺，第10天收獲最終的T細(xì)胞產(chǎn)物。

如圖所示，在電轉(zhuǎn)后：

第0天-完成電轉(zhuǎn)的PBMC靜置4小時恢復(fù)，用含有IL-2和TransAct的X-VIVO培養(yǎng)基進行80%換液。
第1天–進行50%的培養(yǎng)基交換（276ml容量）。
第3天–進行80%的培養(yǎng)基交換（450ml容量），并移除TransAct。
第4天到第9天-進行75%的培養(yǎng)基交換（450ml容量）。
第10天-收集擴增的T細(xì)胞。

在第0、1、4、7和10天取樣分析。

#4 組織層面

HALO數(shù)字病理圖像全景分析技術(shù)在細(xì)胞治療中的應(yīng)用

腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的特征及其對腫瘤治療和預(yù)后的潛在影響是近年來研究的熱點。在組織空間程度上分辨基因表達已成為了解組織內(nèi)復(fù)雜多細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵技術(shù)。RNA和蛋白質(zhì)的分析為理解表達調(diào)控提供了寶貴的信息，能夠在空間的角度對蛋白質(zhì)和基因的表達水平進行分析。為了探索組織內(nèi)細(xì)胞復(fù)雜的相互作用，ISH-IHC的相互結(jié)合為在同一組織樣本上觀察多個RNA和蛋白質(zhì)的表達提供了可能。