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mRNA的xinguan疫苗的成功，離不開幾十年來對脂質(zhì)載體給藥系統(tǒng)的研究。該技術已被用于向目標細胞和組織傳遞各種生物活性分子，如小分子抑制劑和疫苗成分。脂質(zhì)載體技術與傳統(tǒng)的藥物傳遞方式相比有很多優(yōu)勢，包括增加藥物的穩(wěn)定性、生物利用度和分布。 

脂質(zhì)納米顆粒(Lipid nanoparticles，LNPs)是脂質(zhì)載體給藥系統(tǒng)中的重要技術之一，已成為基于寡核苷酸治療藥物的一個重要進展。封裝在脂質(zhì)納米顆粒中的寡核苷酸在傳遞過程中受到保護，不受酶降解，并有效地傳遞到細胞中，在細胞中載體顆粒中的內(nèi)容物被釋放并被翻譯為治療蛋白。鑒于LNPs對基于寡核苷酸的治療具有巨大的革命性潛力，新一波研究人員正在追求基于LNPs更有針對性的應用。

如何設計一個脂質(zhì)納米顆粒的藥物載體？
在選擇脂類及其如何配制成LNPs時，應考慮以下幾個因素。

1.脂質(zhì)摩爾比決定了顆粒的脂質(zhì)組成，并影響其大小、多分散性和功效。建議參考此前已開發(fā)的類似應用，從相關文獻入手，以確定脂質(zhì)摩爾比。下表展示了FDA批準的LNPs藥物的脂質(zhì)摩爾比:

FDA批準的LNPs藥物中的脂質(zhì)摩爾比（*Ionizable cationic lipid : neutral phospholipid : cholesterol : PEGylated lipid）
（相關產(chǎn)品鏈接請見文末）

2.脂質(zhì)與寡核苷酸的重量比影響包封效率。大多數(shù)LNPs的配方為脂質(zhì):寡核苷酸重量比為10:1。

3.可電離脂質(zhì)氮:寡核苷酸磷酸(N:P)摩爾比表示可電離陽離子脂質(zhì)陽離子叔胺與寡核苷酸主鏈陰離子磷酸基團之間的電荷平衡。這一性質(zhì)是電離陽離子脂質(zhì)與寡核苷酸絡合的基礎。LNP的N:P比率通常在6左右。  

4.脂酸解離常數(shù)(脂質(zhì)pKa)是脂質(zhì)在相同濃度下的電離和非電離形態(tài)的pH值。脂質(zhì)pKa影響LNP的包封效率、療效、傳遞和毒性。 對于RNA傳遞，脂質(zhì)pKa一般在6-7之間。已經(jīng)確定了不同給藥途徑的具體范圍。靜脈給藥和肌肉給藥的最佳脂質(zhì)pKa范圍分別為6.2-6.6和6.6-6.9。  

5.水緩沖液的三個重要參數(shù)是它的組成、離子強度和pH值。緩沖液穩(wěn)定溶液中的寡核苷酸，可電離的陽離子脂質(zhì)在酸性水緩沖液中混合后變成質(zhì)子化和正電荷。LNP制劑中常用的緩沖液為25-50 mM的醋酸鈉或檸檬酸鈉，pH為4-5。LNPs被透析到中性緩沖液中，如pH 7.4的PBS中儲存和使用。  

6.顆粒大小改變給藥顆粒的藥代動力學。 更小的顆粒通常有更長的循環(huán)半衰期，因為它們逃避單核吞噬細胞機制的清除。小于100nm的顆?？奢p易通過有孔的內(nèi)皮細胞穿透靶組織。顆粒大小取決于制備方法。根據(jù)LNP制備方法的不同，可以使用擠壓來實現(xiàn)更小、更均勻的顆粒尺寸。  

7.兩種常用的給藥途徑是靜脈注射和肌肉注射。 靜脈給藥的LNP主要分布在肝臟和脾臟，但也分布在肺部。帶凈正電荷、中性電荷和負電荷的LNPs可分別靶向肺、肝和脾。在配方中加入膽固醇或聚乙二醇化脂質(zhì)，以及增加LNP的大小，增加了脾臟的分布。肌肉注射通常用于疫苗，因為它有助于淋巴結(jié)靶向和激活免疫反應。當使用疫苗時，抗原提呈細胞(APCs)，如巨噬細胞和樹突狀細胞，被招募到交付點，在那里它們可以遇到疫苗抗原。 然后它們轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，刺激T細胞反應。值得注意的是，針對某一特定給藥途徑進行優(yōu)化的制劑通常不適用于其他給藥途徑。

8.制備方法決定了LNPs的性質(zhì)，包括尺寸、均勻性和包封效率。 在選擇制備方法時，還應考慮成本、可擴展性、可再現(xiàn)性和時間承諾。

LNPs的制備步驟
本文給出了一系列用于生產(chǎn)LNP的大致流程，包括LNP生命周期的整個范圍，從LNP從實驗臺上的準備開始，到如何使用LNP，以及在體外/體內(nèi)實驗中使用LNP時的預期結(jié)果。

1.LNP的準備
在開始之前，確保所有的供應品、試劑和工作環(huán)境是RNase-free的。siRNA和mRNA在化學上對RNase不穩(wěn)定，RNase是降解RNA寡核苷酸的酶。圖1總結(jié)了LNP形成的步驟。

LNP制備工作流程

2.混合
LNPs的制備方法是將乙醇脂混合物與含有寡核苷酸的酸性水緩沖液混合(如下圖)。通常使用1:3的乙醇脂混合物與水緩沖液的比例。有幾種方法適用于實驗室規(guī)模的小體積LNP生產(chǎn)。

含寡核苷酸的LNP形成示意圖

下文和下表對其中的四種混合方法進行了比較，這些方法適用于一系列從專業(yè)到基本的設備。

微流體混合設備：自動化微流體混合設備或微流控芯片是快速高效制備LNPs的方法。這些器件能夠以高度可控、可重復的方式快速混合，從而獲得均勻的LNPs和高封裝效率。在這些裝置中，乙醇脂混合物和寡核苷酸水溶液的單獨流被迅速結(jié)合。脂質(zhì)納米顆粒形成時，兩股溶液混合，并收集到一個單獨的管中?？梢酝ㄟ^改變流量比和總流量等參數(shù)來微調(diào)LNPs。

T型或y型混合器：這些混合器可以用普通和實惠的實驗室材料組裝。T型或y型接頭可安裝兩個入口，連接到裝有脂質(zhì)混合物或寡核苷酸溶液的單獨注射器，一個出口將LNPs引導到收集管中，進口流量可以控制注射泵。

乙醇注射：此方法適用于所有實驗室。乙醇脂混合物和寡核苷酸水溶液的混合是在磁攪拌板的幫助下進行的。將乙醇脂混合物注入酸性寡核苷酸水溶液中，不斷攪拌，繼續(xù)攪拌30分鐘。但這種方法可能產(chǎn)生更多不均勻的LNPs，包封效率較低，容易發(fā)生變化。

手工混合：這是乙醇注射的一種更簡單的替代方法。 將乙醇脂混合物轉(zhuǎn)移到酸性寡核苷酸水溶液中，通過快速移液混合15秒。 將混合物靜置10分鐘。 與乙醇注射法一樣，手工混合LNPs得到的是包封效率較低的非均質(zhì)LNPs，且結(jié)果多變。

幾種LNP制備方法的特點比較

3.最終制備步驟
LNPs的最終制備是在混合步驟中形成后進行的。 以下步驟可確保這些廢物在貯存和使用期間均質(zhì)、穩(wěn)定，并無任何殘留的化學或生物污染物。

擠壓：擠壓減小了顆粒尺寸，并產(chǎn)生均勻的顆粒尺寸分布。 這一步通常用大量混合方法進行，如乙醇注射和手工混合方法。  

透析：使用適當?shù)姆肿恿拷財?MWCO)管在儲存緩沖液中透析LNPs。 這一步除去未封裝的貨物，多余的脂質(zhì)成分和乙醇從最后的準備。 透析還可以調(diào)節(jié)LNPs從酸性制備緩沖液到中性儲存液的pH值。  

過濾消毒：過濾是LNPs滅菌的推薦方法。過濾-儲存前用0.22μm濾網(wǎng)消毒LNPs，以去除細菌或其他污染物。 對于較大顆粒或高黏性溶液，可采用其他滅菌方法，如高壓滅菌或輻照，盡管這些方法可能會影響嶺土核電站的結(jié)構(gòu)完整性。

LNPs的穩(wěn)定性和儲存
LNPs準備好后，可立即使用或儲存以備以后使用。下面呈現(xiàn)了存儲過程中可能影響LNP解決方案完整性的因素，并提供如何限制存儲不穩(wěn)定性的提示。

1.物理穩(wěn)定性是指LNPs在貯存期間的結(jié)構(gòu)完整性。 粒子融合或聚集，以及封裝貨物的泄漏是物理不穩(wěn)定的例子。

確保大小分布保持小而均勻:  
· 在LNP配方中使用陰離子或聚乙二醇化脂質(zhì)來防止顆粒融合/聚集  

防止貨物滲漏:  
· 在LNP配方中加入膽固醇  

存儲要求:  
· 調(diào)節(jié)存儲溫度，緩沖液和pH值  
· 避免凍融循環(huán)

2.化學穩(wěn)定性決定了LNP脂質(zhì)和貨物組分在分子結(jié)構(gòu)上的抵抗性。 水解、氧化和酯交換可導致寡核苷酸和脂質(zhì)降解或形成脂質(zhì)-寡核苷酸加合物并失去功效。  

控制內(nèi)容藥物的分解:  
· 使用不含RNase的試劑和用品  
· 考慮具有抗降解的糖-磷酸鹽主干修飾的寡核苷酸貨物  

防止脂質(zhì)氧化:  
· 在儲存過程中加入抗氧化劑，如α-tocopherol，或者冷凍保護劑，如海藻糖或蔗糖  

存儲要求:  
· 調(diào)節(jié)存儲溫度，緩沖液和pH值  
· 避免凍融循環(huán)

3.生物穩(wěn)定性與LNPs避免在體外或體內(nèi)系統(tǒng)中早期降解的能力有關。 影響生物穩(wěn)定性的因素包括脂質(zhì)組成、顆粒大小和表面電荷。  

減少血清蛋白調(diào)理:  
· 包括聚乙二醇脂質(zhì)  
· 減少顆粒大小  
· 達到接近中性的zeta電位  
· 增加LNP親水性  

減少早期漏貨:  
· 按照存儲需求  
· 使用可電離的陽離子脂質(zhì)  
· 包含長脂和/或不飽和脂  
· 在LNP配方中加入膽固醇  

4.貯存是影響LNP制劑穩(wěn)定性的一個關鍵參數(shù)。  
一般說來，LNPs可在4°C下保存長達1周，或在-80°C下冷凍干燥保存。存儲溫度、緩沖液和pH值可能需要優(yōu)化。建議在冷凍時加入凍干或不加凍干的低溫保護劑。

LNP的特性
在體外或體內(nèi)使用前對LNP的表征對于實驗的可重復性至關重要。適用于LNP表征的分析方法見下表：

 
（*Adapted from Schoenmaker, L., et al. 2021 and Lin et al. 2014）

1.LNP的大?。↙NP size）描述了LNP的平均直徑。 LNP的大小影響生物分布和細胞攝取，從而影響LNP的有效性。多分散性指數(shù)(PDI)是衡量LNP粒徑分布的一個指標。均勻、大小均勻的樣本具有較小的PDIs，而大小分布不均的樣本具有較大的PDIs。通過優(yōu)化脂質(zhì)成分、增加混合速率、選擇不同的制備方法或添加擠出步驟，可以降低LNP制劑的LNP大小和PDI。  

2.Zeta電位（Zeta potential）是LNP周圍的靜電電位。一般來說，接近中性的zeta電位是可取的。陰離子型LNPs可能被帶負電荷的質(zhì)膜靜電排斥，而陽離子型LNPs可能具有細胞毒性。 zeta電位可以通過改變N:P來調(diào)節(jié)。

3.封裝效率（Encapsulation efficiency）是LNP中所含寡核苷酸的量與混合過程中所使用的起始量的比較。 微流體混合方法產(chǎn)生高的封裝效率。  

4.顆粒濃度（Particle concentration）的定量是必要的，以確保實驗之間的比較結(jié)果。 另外，也可以確定脂質(zhì)和RNA組分的最終濃度。 LNPs可通過超離心濃縮或按需要稀釋。  

5.脂質(zhì)和內(nèi)容藥物的完整性（Lipid and cargo integrity）對LNPs的有效性和穩(wěn)定性至關重要。 有關更多信息，請參閱下面的存儲和穩(wěn)定性部分。

驗證
LNPs通過內(nèi)吞作用被靶細胞內(nèi)吞。內(nèi)含體逃逸是在內(nèi)吞作用后LNP的內(nèi)容物被運送到胞漿的過程。 可電離的陽離子脂質(zhì)在內(nèi)體腔內(nèi)的酸性環(huán)境中質(zhì)子化并帶正電荷，這破壞了帶負電荷的內(nèi)體膜，促進被包裹的寡核苷酸被釋放到胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中翻譯。  

可以通過簡單的分子生物學技術來確認LNPs的體外療效?？煞謩e通過qPCR或Western blot檢測感興趣的基因或蛋白的敲低或表達。基于細胞的報告基因測定也被用于確定LNP的有效性。  

寡核苷酸產(chǎn)物在體內(nèi)的蛋白表達遵循一個目標依賴的時間過程。 編碼功能性蛋白質(zhì)的封裝寡核苷酸在數(shù)小時內(nèi)就會產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度的變化，而那些編碼的貨物可以在幾天到幾周內(nèi)產(chǎn)生抗體反應。 由于寡核苷酸容易降解，因此經(jīng)常需要使用反復給藥方案來實現(xiàn)持續(xù)的蛋白表達。ELISA和多重分析可用于測量靶蛋白和抗體反應，以及細胞因子和趨化因子濃度，這為了解LNP的免疫原性和耐受性提供了深入的認識。  

給藥后LNP的命運取決于脂質(zhì)組成、LNP設計和給藥途徑。經(jīng)靜脈給藥后，LNPs通常分布到肝臟和脾臟。 肌內(nèi)給藥的目的是針對淋巴結(jié)，但經(jīng)常誘導局部和遠端(如肝臟)蛋白表達。 因此，用于LNP的脂質(zhì)在這些組織中也可檢測到。LNPs中使用的脂類具有生物相容性，可迅速降解，一般在給藥后24至48小時內(nèi)消除。為了確定脂質(zhì)組織濃度，可以使用基于質(zhì)譜的方法。

文章部分相關產(chǎn)品：
化合物

LNP探索工具盒

測量LNP誘導的免疫反應的試劑盒