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為了擴(kuò)大誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 的再生醫(yī)學(xué)的前景，人類白細(xì)胞抗原 (HLA) 基因的精確和有效的基因組編輯將有利于最大限度地減少由 HLA 類型錯配引起的免疫排斥。然而，人類 iPSC 系中多個 HLA 基因 的臨床級基因組編輯仍未探索。在這里，我們優(yōu)化了與 GMP級別CRISPRCas9 基因組編輯，以同時編輯 HLA 純合 iPSC 中的三個基因位點(diǎn) （HLA-A、HLA-B 和 CIITA 基因）。在通過單個 gRNA 誘導(dǎo)雙等位基因敲除方面，使用 HLA 純合 iPSC 與雜合 iPSC 相比具有一個主要優(yōu)勢。 RNA-seq 和流式細(xì)胞術(shù) 分析證實了 HLA 的成功去除，并證實了譜系特異性分化為心肌細(xì)胞。 我們還證實，基因組編輯的 iPSC 的多能性由三個胚層分化成功維持。此外，通過全基因組測序、核型分析和光學(xué)基因組作圖分析顯示，在某些克隆中未檢 測到明顯的基因組異常，而在其他克隆中觀察到意外的拷貝數(shù)丟失、染色體易位和復(fù)雜的基因組重排。我們的結(jié)果表明多維分析對于確?；蚪M編輯細(xì)胞的安全性和質(zhì)量的重要性。多維分析對生產(chǎn)和評估流程將成為 iPSC 臨床級基因組編輯的基礎(chǔ)。

我們使用 4D-Nucleofector（Lonza電轉(zhuǎn)儀 可聯(lián)系優(yōu)寧維獲取產(chǎn)品資料） 將 Cas9 蛋白和兩個 gRNA （ HLA-A24-ex2g1 和 CIITA-ex3g5 ） 電轉(zhuǎn)化到 FfI14s04 克隆中。在干擾素 (IFN)-g 刺激 2 天后，通過 HLAA 或 B 抗體染色和流式細(xì)胞術(shù) (FCM) 證實了大塊細(xì)胞 群中 HLA-A 和 HLA-B 蛋白的敲除效率。結(jié)果顯示，77.9% 的細(xì)胞表面HLA-A蛋白表達(dá)陰性，72.1%的細(xì)胞HLA-B蛋白表達(dá)陰性，提示實現(xiàn)了雙等位基因敲除。

為了更詳細(xì)地檢查 HLA-A、HLA-B 和 CIITA 目標(biāo)位點(diǎn) 的插入或刪除 (indel) 效率，進(jìn)行了目標(biāo)位點(diǎn)克隆和測序。我們從 41 個分析的克隆 (73.1%) 中選擇了 30 個 HLA-A 敲除 (KO) iPSC 的克隆。我們進(jìn)一步對這些克隆進(jìn)行 Sanger 測序、 核型分析、WGS、RNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)分析，并評估分化潛能。 圖1C）。

如圖所示： 
PCR+Sanger: 19/30 indel mutations
WGS: 3/11 large deletions, 1.4Mbp;1 off-target（與成瘤相關(guān)）
核型： 7/30 translocations
OGM：隨機(jī)選取了9個進(jìn)行分析，4 個有易位
結(jié)論：基因編輯導(dǎo)致的unwanted effect 發(fā)生比例很高

我們通過測序和OGM 相結(jié)合，最終能更全面的檢測到Car-T的細(xì)胞質(zhì)量。

Bionano 技術(shù)的介紹

Bionano全基因組光學(xué)圖譜 (Optical Genome Mapping/OGM) 技術(shù)從基本原理上來說與染色體核型類似: 是對完整DNA分子上標(biāo)記信號模式的直接可視化分析。不同的地方在于，相對于染色體核型中約500個標(biāo)記條帶，OGM技術(shù)能夠在全基因組范圍內(nèi)擁有500,000個左右的標(biāo)記信號。這使得OGM能夠以比核型分析高出10000x的分辨率檢測結(jié)構(gòu)變異：OGM分辨率約500bp vs 染色體核型分析約5Mbp。

染色體核型技術(shù)
上世紀(jì)六十年代發(fā)明的這項技術(shù)極大推動了人類遺傳學(xué)的發(fā)展。研究者們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分裂過程中的某一階段，染色體會自我壓縮；這時利用特殊染料（Giemsa等）對其進(jìn)行染色，會在不同染色體上形成不同的染色條帶模式；隨后在顯微鏡下觀察這些染色條帶就能區(qū)分出不同的染色體（圖1）。

不同的染色體都有各自特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)（包括染色體的長度、著絲點(diǎn)位置、臂比、隨體大小等）特征，而且這種形態(tài)特征是相對穩(wěn)定的。在發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的樣本中可以觀察到染色體形態(tài)的異常變化進(jìn)而判斷不同變異的類型和大小（插入、缺失、易位、倒位等）。

染色體核型分析目前已廣泛應(yīng)用于各大醫(yī)院檢驗科、血液科、婦產(chǎn)科、生殖中心、計劃生育研究所、職業(yè)病防治所以及高校和科研院所等單位。主要應(yīng)用范圍包括：遺傳疾病診斷、產(chǎn)前診斷、白血病診斷等。然而由于核型分析染色是針對的極度壓縮的DNA, 目前成熟的方法能夠染色的條帶也僅有500左右，因此只能在5Mbp的分辨率范圍觀察，無法對更小的變異進(jìn)行判斷。

圖1 Giemsa染色后的一個男性細(xì)胞核型1

Bionano 全基因組光學(xué)圖譜技術(shù)

與染色體核型類似，OGM也是將DNA標(biāo)記染色后在顯微鏡下直接觀察。不同的是OGM將染色拉直后的DNA分子在單分子高分辨熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照；同時采用序列特異的熒光轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行標(biāo)記，人類全基因組范圍內(nèi)可標(biāo)記位點(diǎn)約500,000個。因此能夠?qū)⒔Y(jié)構(gòu)變異的分辨率從上兆堿基提高到幾百堿基。

整個OGM技術(shù)流程從頭開始分別為：抽提超長分子DNA、序列特異熒光標(biāo)記和DNA骨架染色、Saphyr 芯片使單個DNA分子呈線性穿過納米通道、Saphyr 對泳動的單個DNA分子進(jìn)行高分辨成像、光學(xué)圖譜組裝并報告結(jié)構(gòu)變異。

抽提超長分子DNA
輸入樣本的類型和質(zhì)量是決定能否獲得高質(zhì)量全基因組圖譜的最關(guān)鍵因素。超長分子DNA中包含了結(jié)構(gòu)變異中的信息，如果DNA分子太短，這種信息就丟失了。Bionano新推出的SP抽提試劑盒創(chuàng)新性地利用DNA吸附磁盤來分離富集樣本中的DNA分子，能夠獲得兆堿基級別的高分子量DNA（圖2）。同時單個樣本實驗流程僅為4到6個小時，手工操作時間不到2小時。

圖2 Bionano SP抽提試劑盒流程

序列特異熒光標(biāo)記和DNA骨架染色
得到高分子量DNA后，就可以對其進(jìn)行特異性標(biāo)記和染色。Bionano推出的直接標(biāo)記染色（Direct Label and Stain/DLS）技術(shù)擁有極簡的流程和出色的表現(xiàn)。其原理是首先使用一種熒光轉(zhuǎn)移酶，該酶特異性識別基因組中6堿基的序列模式（CTTAAG motif），在這個序列位置上轉(zhuǎn)移一個綠色熒光標(biāo)記；隨后將整個DNA分子骨架用藍(lán)色染料染色；從而得到一系列帶有綠色熒光信號的藍(lán)色DNA分子（圖3）。人類基因組中CTTAAG出現(xiàn)的頻率約為每100kb長度DNA 14到17個位點(diǎn)。

圖3 DLS標(biāo)記原理

Saphyr 芯片使單個DNA分子呈線性穿過納米通道

一旦gDNA被標(biāo)記，它就可以被加載到芯片上并在Saphyr儀器上運(yùn)行。Saphyr芯片由半導(dǎo)體圓晶切割組裝而來（圖4），每個芯片上都包含樣本入口（inlet）、樣本出口（outlet）、DNA分離柱（Pillar Region），微米通道（Microchannels）和多達(dá)120,000個納米通道（Nanochannels）。

圖4 Saphyr芯片結(jié)構(gòu)

標(biāo)記好的DNA被加載到Saphyr芯片上后，在一定的電壓作用下，從樣本入口向樣本出口流動。溶液中的DNA處于卷曲成團(tuán)狀態(tài)；首先成團(tuán)的DNA進(jìn)入Pillar Region被分離柱分開；隨后DNA進(jìn)入微米級通道被部分拉長；最后由微米級通道進(jìn)入納米通道，單個DNA雙鏈分子被*拉直（圖5和視頻）。

圖5 DNA在Saphyr芯片上的流動狀態(tài)

 【視頻】 DNA在Saphyr芯片上的流動狀態(tài)

Saphyr 對泳動的單個DNA分子進(jìn)行高分辨成像
納米通道僅能容納單分子DNA通過。在通過過程中，Saphyr儀器內(nèi)部的高分辨率熒光顯微鏡對DNA進(jìn)行拍照，獲得原始圖像（圖6）。圖中每條藍(lán)色直線就是一條被拉直的DNA分子，DNA分子長度中位數(shù)在200kb以上，最長可以達(dá)到Mb級別。藍(lán)色DNA分子上的綠色熒光點(diǎn)是被標(biāo)記上熒光的CTTAAG位點(diǎn)。儀器會自動將原始圖像轉(zhuǎn)換成分子文件，包含有每條分子的長度信息及每條分子上CTTAAG motif的具體位置信息。最終的圖像中，每個像素代表約500個堿基對。

圖6 納米通道和原始圖像

光學(xué)圖譜組裝
利用DNA分子上CTTAAG的位置信息，Bionano自帶分析軟件會將單獨(dú)的分子組裝成超長的基因組組裝圖譜（圖7）。組裝的圖譜最大可到百兆堿基。

圖7 原始圖像轉(zhuǎn)換和基因組圖譜組裝

結(jié)構(gòu)變異報告
組裝好光學(xué)圖譜后，根據(jù)不同的應(yīng)用軟件可進(jìn)行后續(xù)結(jié)構(gòu)變異檢測(SV detection)，體細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異分析（Rare Variant Pipeline）, FSHD變異檢測以及基因組混合組裝（Hybrid Scaffolding）。以SV detection為例，軟件通過比較組裝后圖譜與參考基因組中CTTAAG motif圖譜之間的差異來判斷是否發(fā)生了不同類型的結(jié)構(gòu)變異（圖8）。圖中藍(lán)色圖譜是由樣本實際數(shù)據(jù)拼接而成；綠色是參考基因組圖譜；圖譜上的垂線表示CTTAAG的標(biāo)記（如果樣本和參考基因組上的標(biāo)記對應(yīng)，垂線顯示藍(lán)色，并且上下圖譜之間有灰色連線表示對應(yīng)；如果不能對應(yīng)，垂線顯示黃色）；軟件可以很容易根據(jù)CTTAAG標(biāo)記的模式不同找出樣本中的不同類型SV。如果發(fā)現(xiàn)樣本中某兩個標(biāo)記之間計算的距離小于參考基因組，則可認(rèn)為這里發(fā)生了序列缺失；反之大則提示有插入變異（圖8左）。如發(fā)現(xiàn)標(biāo)記模式相對于標(biāo)準(zhǔn)基因組有特定擴(kuò)增，則可認(rèn)定為重復(fù)變異（圖8中）。如果樣本圖譜出現(xiàn)來自兩條染色體的標(biāo)記模式或同一條染色體上不同區(qū)域的標(biāo)記模式連接在一起，或者相對于參考基因組標(biāo)記模式發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，則可判斷為易位或倒位等平衡性結(jié)構(gòu)變異（圖8右）。

圖8 SV detection檢測

針對somatic SV檢測的Rare variant analysis算法中，通過將單分子比對到參考基因組上檢測單分子InDel，和對SV breakpoint包含的分子進(jìn)行局部組裝（local assembly）后檢測低頻的重復(fù)（duplication）,倒位（inversion）,易位（translocation）。

除通過map算法比對進(jìn)行SV calling以外，Bionano CN算法會通過對molecule coverage進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算copy number gain/loss，檢測拷貝數(shù)變異。