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          gⅥ-cDNA融合噬菌體親和選擇

          來(lái)源:上海寶葉生物科技有限公司   2012年09月18日 08:56  

          每一輪的親和選擇包括原始的或富集的gⅥ—cDNA文庫(kù)中噬菌粒顆粒的獲取和純化以及它們自身的淘選過(guò)程。介紹兩種不同的方法來(lái)抽提特異的噬菌體。

           
               1噬菌體文庫(kù)的獲取和純化
              在每輪淘選循環(huán)中的起始部分,(富集的)Topl0F,細(xì)胞經(jīng)輔助噬菌體被雙重感染以便產(chǎn)生和純化gⅥ—cDNAt噬菌粒顆粒,從而進(jìn)行下一輪的淘選。在淘選過(guò)程中,如果沒(méi)有特異的緩沖液且噬菌體對(duì)誘餌的親和力較高(如免疫親和篩選),此時(shí)經(jīng)雙重感染獲得的噬菌體顆粒并不一定要純化。
           
              2生物素化的誘餌的制備
              用不同的配體標(biāo)準(zhǔn)化淘選的一個(gè)方法是用普通的標(biāo)記物(如生物素)來(lái)標(biāo)記誘餌,或使用鏈霉親和素包被的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)的平板孔或小珠來(lái)淘選。兩個(gè)有效的(氨基反應(yīng)的)生物素化試劑是二硫化N—羥基丁二酰亞胺生物素酯(biotin disulfide N—hydrox—ysuccinimideester)和生物素化氨基己酸—N—羥基丁二酰亞胺(biotinamidocaproate N—hydroxysuccinimide)(Sigma)。與后者試劑相比,前者在生物素和誘餌之間有一個(gè)可切斷的二硫鍵,它是在生物淘選過(guò)程中特異抽提(用50mmol/L二硫蘇糖醇)噬菌體的試劑,整個(gè)生物素的水平可用HABA方法來(lái)評(píng)估。
           
              3用生物素化的誘餌的淘選過(guò)程
              在用生物素化的誘餌來(lái)親和純化gⅥ—cDNA噬菌體顆粒的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程中,用鏈霉親和素包被的磁珠預(yù)處理噬菌粒文庫(kù),以便首先除去與鏈霉素非特異結(jié)合的噬菌體顆粒。在第三輪淘選后,個(gè)別克隆可用ELISA來(lái)分析或進(jìn)行額外的淘選過(guò)程。然而,必須注意到成功的展示要求pⅥ融合蛋白定位在外周胞質(zhì)上,正確地折疊并組合成完整的噬菌體顆粒。這樣的話,如果表達(dá)pⅥ融合蛋白的結(jié)合者干擾了選擇過(guò)程,那么將會(huì)稀釋“非干擾”結(jié)合者的濃度。
           
              4免疫親和淘選過(guò)程
              用抗血清來(lái)分離gⅥ—cDNA噬菌體顆粒,而且所需要的抗血清是微量的(微升數(shù)量的)。

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