Mark Crowe, Bettina Berger and Mark Tester

2011年10月

早在1999年，Jefferies教授利用傳統(tǒng)、主觀的人眼觀察方法對(duì)硼脅迫條件下大麥的表型進(jìn)行了鑒定，成功獲得了四個(gè)與耐硼脅迫相關(guān)的QTLs，它們分別控制四種不同的表型。近期，Julie Hayes和她的團(tuán)隊(duì)在澳大利亞功能基因組學(xué)研究中心（Australia Center for Plant Functional Genomics, ACPFG），采用相同的QTL定位群體進(jìn)行了第二個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。試驗(yàn)中她們用鍺代替硼對(duì)大麥進(jìn)行脅迫處理，利用LemnaTec全自動(dòng)成像系統(tǒng)（與植物加速器Plant Accelerator相似）對(duì)植株表型進(jìn)行鑒定和分析，再一次成功驗(yàn)證了先前獲得的QTLs與某一表型密切相關(guān)。本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)利用全自動(dòng)成像系統(tǒng)鑒定分析植物表型，具有更大的潛在優(yōu)勢(shì)，這其中便包含了可以大幅度降低人力投入，以及簡(jiǎn)便的對(duì)一些更加復(fù)雜的抗性QTL的發(fā)掘和鑒定等等。

 

硼是一種植物生長(zhǎng)所必需的微量元素，但土壤中的硼含量較高（＞1-2ppm）時(shí)會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致糧食作物產(chǎn)量顯著下降，這在澳大利亞南部、西亞和北非部分地區(qū)較為常見(jiàn)。大麥中存在硼耐性的遺傳變異， Sahara 3771對(duì)硼脅迫具有較強(qiáng)的耐受能力，而Clipper則對(duì)硼脅迫較為敏感，本研究便是利用它們的雜交群體作為QTL定位群體。植物對(duì)于硼脅迫的響應(yīng)是多方面的，其中主要包括組織排除、組織耐性、根系形態(tài)改變等等，大麥中zui明顯的特征是葉片從頂部逐漸萎黃壞死（如圖1），但這并非與耐性必然相關(guān)。

 

鍺的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與硼（還有硅）相似，但不同的是，鍺并非植物生長(zhǎng)所必需的微量元素，也不會(huì)在自然情況下過(guò)量抑制植物生長(zhǎng)。然而，它與硅化學(xué)屬性的相似性，就注定其在植物硅元素吸收研究中具有非常重要的作用。此外，在大麥中鍺還可以通過(guò)一個(gè)硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HvNIP2;1）進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。這表明在適合的濃度條件下，它能夠誘發(fā)與硼脅迫相似的癥狀表征，并可能與之前定位的QTL連鎖。本研究利用Sahara 3771（硼-耐受型變種）和Clipper（硼-敏感型變種）的雜交群體作為QTL定位群體，比較了三種不同的方法：傳統(tǒng)的人眼評(píng)定和破壞性表型測(cè)定方法；采用LemnaTec成像和分析技術(shù)的半自動(dòng)破壞性測(cè)定方法；假定采用植物加速器LemnaTec系統(tǒng)的全自動(dòng)測(cè)定方法。

Jefferies的實(shí)驗(yàn)篩選了四個(gè)不同的表型：溶液培養(yǎng)相對(duì)根長(zhǎng)、壞死的葉片損傷、組織硼濃度和干物質(zhì)量。其中組織硼濃度，即使采用先進(jìn)的植物加速器成像系統(tǒng)也必須破壞植物，因此該指標(biāo)不列入比較之列，而其他三個(gè)指標(biāo)能夠通過(guò)圖像數(shù)據(jù)分析測(cè)定或準(zhǔn)確估計(jì)。Julie Hayes的鍺毒素測(cè)定實(shí)驗(yàn)僅對(duì)葉片癥狀進(jìn)行了測(cè)定。

 

從定位群體中選擇150個(gè)株系，每個(gè)株系2次重復(fù)，在濾紙（對(duì)照：不含硼溶液；處理：100mg/l硼溶液）上發(fā)芽，之后轉(zhuǎn)移至箔紙包被的卷筒紙中生長(zhǎng)12天，選取zui長(zhǎng)根測(cè)定。相對(duì)根長(zhǎng)（RRL）以處理根長(zhǎng)占對(duì)照根長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。

 

每個(gè)株系的2次重復(fù)都種在對(duì)照和硼處理（100mg/kg）土壤中，四周后對(duì)每個(gè)植株葉片壞死程度測(cè)定分級(jí)：1（無(wú)可見(jiàn)癥狀）-6（＞90%壞死）。

 

獲得植物葉片損傷后一周，所有植物從地平面以上1cm收獲，烘干稱(chēng)重。

該表型測(cè)定方法的詳細(xì)步驟，請(qǐng)參見(jiàn)Jefferies et al, 1999.

 

從每個(gè)株系中選擇3-4株幼苗，首先通過(guò)水培法培養(yǎng)5天，然后用40μM的GeO₂進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)9天。隨后將所有植株取出水平放置，利用LemnaTec Scanalyzer^3D系統(tǒng)從上面對(duì)植物進(jìn)行成像并加以分析，設(shè)置適當(dāng)分析閾值記錄壞死組織占整個(gè)植株葉片的百分?jǐn)?shù)。在成像的同時(shí)，通過(guò)肉眼對(duì)每個(gè)植株的葉片壞死程度進(jìn)行觀察和分級(jí)。

 

從定位群體中選擇150個(gè)株系，每個(gè)株系2次重復(fù)，然后按照傳統(tǒng)表型測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的方法對(duì)所有單株進(jìn)行培養(yǎng)和硼處理。5周后，將所有植株轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)溫室中培養(yǎng)，并利用可見(jiàn)光成像單元對(duì)每一個(gè)單株從三個(gè)方向（頂部和兩個(gè)側(cè)面）進(jìn)行成像，獲得每個(gè)植株的葉面積，進(jìn)而估算其生物量，同時(shí)葉片壞死程度可見(jiàn)光圖像的顏色分析或者熒光成像的葉綠素健康程度分析獲得。

 

根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)需要為每一個(gè)株系設(shè)置一個(gè)額外的、無(wú)硼處理的對(duì)照，因?yàn)檫@里的根長(zhǎng)是相對(duì)根長(zhǎng)而并非值。對(duì)照和處理植株都被種植在植物加速器特定的根系觀測(cè)盆（透明，高400mm，寬120mm，深40mm）中，通過(guò)可見(jiàn)光成像對(duì)附著于透明測(cè)量盆表面的根系進(jìn)行成像，對(duì)圖像進(jìn)行分析獲得植株根長(zhǎng)。值得注意的是，這些植株可以取代上面所提到的進(jìn)行生物量和葉片損傷測(cè)定的植株，不需要額外增加植株數(shù)量。此外，還可以在根系未長(zhǎng)至觀測(cè)盆底部的時(shí)候額外進(jìn)行一次成像。

 

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)定位了與硼耐性評(píng)定相關(guān)的4個(gè)QTL：葉片癥狀2H染色體QTL、相對(duì)根長(zhǎng)的3H染色體QTL、組織硼濃度的6H染色體QTL和所有4種表型（第4種為生物量）的4H染色體QTL，這與之前的研究結(jié)果（三個(gè)主效基因座位與硼耐受性連鎖）是一致的。

 

基于圖像的半自動(dòng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)再次發(fā)現(xiàn)了之前研究中的兩個(gè)QTL，即葉片癥狀（2H）和組織硼濃度（6H），這或多或少讓人覺(jué)得有一些奇怪，盡管采用了不同的測(cè)定方法。以往的研究表明，6H QTL（硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HvNIP2;1）的候選基因也能轉(zhuǎn)運(yùn)鍺，但并沒(méi)有表明與葉片癥狀連鎖的報(bào)道。而另一方面，2H QTL雖然與葉片癥狀緊密連鎖，但也沒(méi)有證據(jù)表明它在無(wú)硼脅迫條件下具有顯著作用。更為有趣的是，該方法并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)4H QTL，該QTL的候選基因是一個(gè)硼酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且具有很強(qiáng)的特異性，并不像其它兩個(gè)QTL那樣具有硼/鍺交互活性。與傳統(tǒng)觀察方法一樣，圖像分析方法同樣可以獲得相同的QTL位點(diǎn)，僅在主峰上面一個(gè)微小的次級(jí)峰存在差異（如圖2），該區(qū)域的一個(gè)基因能夠控制開(kāi)花時(shí)間，還可能與幼苗發(fā)育速度和葉片大小形態(tài)有密切關(guān)系。傳統(tǒng)觀察方法分析獲得的該次級(jí)峰稍大，這表明該方法受成熟度差異影響較大，而該差異并非由于鍺脅迫造成的。

 

當(dāng)然，對(duì)于假想的全自動(dòng)植物加速器實(shí)驗(yàn)，我們沒(méi)有任何數(shù)據(jù)，但是種種情況表明運(yùn)用這種方法，我們很可能會(huì)鑒定出以上的3個(gè)QTLs，甚至是6H QTL（第二個(gè)試驗(yàn)中與葉片癥狀密切相關(guān)，但測(cè)定的前提是破壞植物葉片）。此外，通過(guò)這種全自動(dòng)的方法，我們就能夠客觀、準(zhǔn)確的定位更多的QTL，即使是一些微小表型變化的基因。

 

 圖2 與鍺脅迫引起葉片癥狀連鎖的2H QTL，分別采用LemnaTec圖像分析方法（左）和傳統(tǒng)的觀察方法（右）。圓圈區(qū)域突出顯示了一個(gè)次級(jí)QTL，與圖像分析法相比，運(yùn)用傳統(tǒng)方法獲得的數(shù)據(jù)更加顯著。

如上所述，即使在某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，植物加速器也能夠顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。Jefferies所采用的測(cè)量根長(zhǎng)和葉片損傷的方法會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間，并受人主觀性的影響，就連Julie Hayes也表示采用半自動(dòng)成像方法也需要花費(fèi)兩天的時(shí)間對(duì)植株進(jìn)行成像，如果能夠采用新型的全自動(dòng)成像技術(shù)，畢竟會(huì)節(jié)約大量的人力和時(shí)間，并大大增加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的客觀性。這些都表明利用植物加速器全自動(dòng)成像技術(shù)，具有其他方法所*的優(yōu)勢(shì)，獲得的大量數(shù)據(jù)信息對(duì)于更深入的發(fā)現(xiàn)和鑒定硼脅迫響應(yīng)QTL具有重要意義！除此之外，利用植物加速器全自動(dòng)成像技術(shù)，還可以觀察記錄一定時(shí)期內(nèi)植物對(duì)硼/鍺脅迫的響應(yīng)情況，能夠做到每隔一天便進(jìn)行一次根長(zhǎng)、組織損傷和葉面積的測(cè)定，同時(shí)獲得更多更可靠的表型數(shù)據(jù)信息，從而發(fā)現(xiàn)植物表型的特異變化，發(fā)掘并定位更多與硼/鍺脅迫相關(guān)的QTL。

 

（1）       對(duì)于一些簡(jiǎn)單的遺傳性狀（如硼脅迫耐性，只有4個(gè)主效基因座位），植物加速器全自動(dòng)成像技術(shù)依然比傳統(tǒng)的觀察方法更具優(yōu)勢(shì)，但可能沒(méi)有研究一些復(fù)雜性狀（性狀表達(dá)呈連續(xù)分布）更加明顯；

（2）       比較三種方法所需要的成本，僅葉片癥狀分析就需要$1000左右（不包括定位群體的構(gòu)建和表型表達(dá)后的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但包括了人力、耗材以及溫室費(fèi)用）。然而，利用植物加速器全自動(dòng)成像系統(tǒng)估算生物量則沒(méi)有任何附加費(fèi)用，這幾乎節(jié)約了一半的成本，而根系長(zhǎng)度測(cè)定（$1000月）與手工測(cè)定費(fèi)用基本持平。

（3）        

感謝Julie Hayes對(duì)本文實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)字圖像的詳細(xì)說(shuō)明，對(duì)表型數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析的深入注解，同時(shí)感謝Tim Sutton對(duì)本文提出的寶貴意見(jiàn)和建議。

 

1）      Jefferies SP, Barr AR, Karakousis A, Kretschmer JM, Manning S, Chalmers KJ, Nelson JC, Islam A, Langridge P. 1999. Mapping of chromosome regions conferring boron toxicity tolerance in barley （Hordeum vulgare L.）. Theoretical and Applied Genetics 98: 1293–1303.

2）      Hayes J, Pallotta M, Sutton T. 2010. The relationship between boron （B） and germanium （Ge） toxicity tolerance in barley. Unpublished presentation.

3）      Brenchley WE, Warington K. 1927. The role of boron in the growth of plants. Annals of Botany 41:167–187.

4）      Schnurbusch T, Hayes J, Sutton T. 2010. Boron toxicity tolerance in wheat and barley: Australian perspectives. Breeding Science 60: 297–304.

5）      Cartwright B, Zarcinas BA, Mayfield AH. 1984. Toxic concentrations of boron in a red-brown earth at Gladstone, South Australia. Australian Journal of Soil Research 22: 261-272.

6）      ICARDA Annual Report. 1993. Breeding winter barley for high boron soils.

7）      Jenkin MJ. 1993. The genetics of boron tolerance in barley. PhD thesis, Adelaide University

8）      Nikolic M, Nikolic N, Liang Y, Kirkby EA, Romheld, V. 2007. Germanium-68 as an adequate tracer for silicon transport in plants. Characterization of silicon uptake in different crop species. Plant Physiology 143: 495-503.

9）      Schnurbusch T, Hayes J, Hrmova M, Baumann U, Ramesh SA, Tyerman SD, Langridge P, Sutton T. 2010. Boron Toxicity Tolerance in Barley through Reduced Expression of the Multifunctional Aquaporin HvNIP2;1. Plant Physiology 153: 1706–1715.

10）   Langridge P, Karakousis A, Collins N, Kretschmer J, Manning S. 1995. A consensus linkage map of barley （Hordeum vulgare L.）. Mol Breed 1: 389-395

11）   Sutton T, Baumann U, Hayes J, Collins NC, Shi B-J, Schnurbusch T, Hay A, Mayo G, Pallotta M, Tester M, Langridge P. 2007. Boron-toxicity tolerance in barley arising from efflux transporter amplification. Science 318（5855）: 1446-1449