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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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11402ES60雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒
| 參考價(jià): | 面議 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 11402ES60 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：5954更新時(shí)間：2022-04-03 17:35:22
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 11402ES60 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） | *（元） |
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒 | 11402ES60 | 100T | 1265.00 | 752.00 |
11402ES80 | 1000T | 9965.00 | 6852.00 |
產(chǎn)品描述
螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的過程中會(huì)發(fā)出波長為560 nm左右的生物螢光。海腎螢光素酶（Renilla luciferase）是一種分子量約為36 kDa的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的過程中會(huì)發(fā)出波長為480nm左右的生物熒光。兩種生物熒光都可通過化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測定。檢測原理如圖所示：
圖1：螢火蟲和海腎螢光素酶檢測原理圖
通常將目的基因的5′UTR或啟動(dòng)子克隆至Firefly Luciferase的上游，或3′UTR克隆至Firefly Luciferase的下游，通過檢測螢火蟲螢光素酶的量來檢測啟動(dòng)子或調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Renilla Luciferase作為內(nèi)參，來消除細(xì)胞數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率等的差異。Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以螢光素為底物來檢測螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因的活性，之后在淬滅該螢光反應(yīng)的同時(shí)，以腔腸素為底物檢測海腎螢光素酶報(bào)告基因的活性。該試劑盒具有靈敏度高的特點(diǎn)。
產(chǎn)品組分
組分編號 | 組分名稱 | 產(chǎn)品編號/規(guī)格 | |
11402ES60（100 T） | 11402ES80（1000 T） | ||
11402-A | 細(xì)胞裂解液 | 20 mL | 10×20 mL |
11402-B | 螢火蟲螢光素酶緩沖液 | 10 mL | 10×10 mL |
11402-C | 螢火蟲螢光素酶底物（50 ×） | 200 μL | 10×200 μL |
11402-D | 海腎螢光素酶緩沖液 | 10 mL | 10×10 mL |
運(yùn)輸和保存方式
干冰運(yùn)輸。 -20℃保存，有效期1年。
螢火蟲螢光素酶反應(yīng)工作液和海腎螢光素酶反應(yīng)工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，且不能反復(fù)凍融，建議分裝-20℃或-80℃保存。
實(shí)驗(yàn)步驟
I.前處理
1.細(xì)胞
1）構(gòu)建相應(yīng)的載體。
2）轉(zhuǎn)染步驟請參照相關(guān)的說明書。
3）將細(xì)胞裂解液充分混勻，按如下方式加入細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞。
a: 對于貼壁細(xì)胞，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液，按照下表比例加入細(xì)胞裂解液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂解液*覆蓋細(xì)胞；
b: 對于懸浮細(xì)胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液。
細(xì)胞培養(yǎng)板 | 96孔板 | 48孔板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 |
裂解液加入量 | 100 μL | 150 μL | 200 μL | 300 μL | 500 μL |
冰上孵育5 min，充分裂解細(xì)胞。
【注】：裂解產(chǎn)物可室溫保存6 h；4℃保存16 h；-80℃可長期存放。（裂解產(chǎn)物不能多次反復(fù)凍融），本試劑盒裂解液數(shù)量按照24孔板添加量進(jìn)行配置，如需要更多可單獨(dú)購買（CAT#11406）。
5）（選作）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。
2.葉片組織（以煙草葉片為例，僅供參考）
1）構(gòu)建相應(yīng)的載體。
2）挑取轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到2 mL LB液體培養(yǎng)基（添加相應(yīng)抗生素）中，28℃ 220 rpm培養(yǎng)過夜。
3）農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600為1.0，1700× g離心5 min收集菌體后，用1/2MS液體培養(yǎng)基清洗菌體2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌的OD600調(diào)至1.0。
4）將待檢測的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行混合，使每種菌液的OD600為0.5。
5）選取生長期為1個(gè)月左右*伸展的煙草葉片，將混合好的菌液用1 mL注射器(去掉針頭)從煙草葉背面進(jìn)行注射。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，需要將對照載體和待檢測目標(biāo)載體的菌液注射在同一葉片的不同部位上, 以保證相同的生長背景。
6）正常溫室生長條件下，24-48 h即可取樣觀察。
7）取3-4片直徑為6-8 mm的葉盤，放入2 mL的EP管（提前放入3-4個(gè)小鋼珠）中，液氮中冷凍，使用破碎儀進(jìn)行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎*后在EP管中加入100 μL裂解液。
8）冰上孵育5 min左右，充分裂解葉片。
9）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。
3.原生質(zhì)體（僅供參考）
構(gòu)建相應(yīng)的載體。
制備原生質(zhì)體（參考文獻(xiàn)：Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565–1572）。
在2 mL EP管中加入相應(yīng)的載體（加入量需要摸索），加入100 μL原生質(zhì)體懸浮液。輕搖混勻后，加入110 μL PEG-CaCl2溶液，輕彈混勻。在室溫放置10-15 min。
4）加入440 μL W5溶液，上下顛倒以停止轉(zhuǎn)化。
5）200 × g 室溫離心5 min，棄去上清，加入800 μL WI溶液重懸原生質(zhì)體。
室溫避光培養(yǎng)16-24 h。
7）將原生質(zhì)體加入2 mL離心管中，離心收集原生質(zhì)體，加入100 μL左右的裂解液。
8）冰上孵育5 min左右，充分裂解原生質(zhì)體。
9）（選做）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。
II.熒光檢測
1）取20 μL裂解液，加至培養(yǎng)板中。按照實(shí)驗(yàn)需要，可設(shè)置3孔-5孔重復(fù)。
2）配制螢火蟲螢光素酶反應(yīng)工作液和海腎螢光素酶反應(yīng)液，即螢火蟲螢光素酶底物（50 ×）和海腎螢光素酶底物（50 ×）
分別用對應(yīng)的緩沖液稀釋至1 ×工作液。并孵育至室溫。
3）加入100 μL螢火蟲螢光素酶反應(yīng)液，震板混勻，檢測螢火蟲螢光素酶的活力，檢測盡量在30 min內(nèi)完成。
4）加入100 μL海腎螢光素酶反應(yīng)液，震板混勻，檢測海腎螢光素酶的活力，檢測盡量在30 min內(nèi)完成。
5）分析數(shù)據(jù)。
①實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，在每個(gè)培養(yǎng)板中都應(yīng)設(shè)置對照組、實(shí)驗(yàn)組和空白對照組。為了保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，理論上每個(gè)實(shí)驗(yàn)組（包括對照組）都應(yīng)當(dāng)減去空白對照組的螢火蟲和海腎螢光素酶的發(fā)光測量值。
a.空白對照組：
背景F：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑。
背景R：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑+海腎螢光素酶檢測試劑。
注：空白對照組的樣品量必須與實(shí)驗(yàn)樣品量相同，包含與實(shí)驗(yàn)樣品相同的培養(yǎng)基/血清組合，并加上*相同的檢測試劑。
b.實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)化合物處理(即實(shí)驗(yàn)組F和實(shí)驗(yàn)組R)。
c.對照組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞不經(jīng)處理，用以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(即對照組F和對照組R)。
②計(jì)算結(jié)果：
實(shí)驗(yàn)組比值=(實(shí)驗(yàn)組F-背景F）/(實(shí)驗(yàn)組R-背景R)。
對照組比值=(對照組F-背景F）/(對照組R-背景R)。
表達(dá)倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組比值/對照組比值。
圖2：細(xì)胞樣品螢火蟲和海腎螢光素酶檢測流程圖
注意事項(xiàng)
1）檢測過程中需自備耗材和設(shè)備包括如下：PBS、100 μL移液器或者排槍、不透光白色酶標(biāo)板、Luminometer發(fā)光計(jì)、多功能酶標(biāo)儀或者其他能夠檢測生物發(fā)光的儀器；
2）反應(yīng)溫度：酶促反應(yīng)對溫度較為敏感，加樣檢測前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）再使用；
3）檢測儀器：能檢測化學(xué)發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測得的光信號值也會(huì)不同；
4）檢測設(shè)置：Luminescence，350-700 nm，建議檢測時(shí)間設(shè)為2-10 sec；
5）檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標(biāo)板。黑色酶標(biāo)板也可用，但因黑色會(huì)吸收光信號，可能會(huì)降低信號；
6）單管熒光測定儀測定，每個(gè)樣品與測定試劑混合后到測定前的時(shí)間應(yīng)保持一致；
7）E組分海腎螢光素酶底物易揮發(fā)，注意密封保存；
8）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套。
9）本產(chǎn)品僅作科研用途！
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit輝光型螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒 | 11404ES60/80 | 100/1000 T |
Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒 | 11405ES60/80 | 100/1000 T |
Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒 | 11401ES60/76/80 | 100/500/1000 T |
pGM-CMV Luciferase Reporter Plasmid Positive Control pGM-CMV-Luc熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒陽性對照 | 11556ES03 | 1 μg |
Luciferase Reporter Plasmid negative control （熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒陰性對照） | 11555ES03 | 1 μg |
pGMLR-TK Luciferase Reporter Plasmid（pGMLR-TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒） | 11557ES03 | 1 μg |
pGMLR-CMV Luciferase Reporter Plasmid（pGMLR-CMV海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒） | 11558ES03 | 1 μg |
Hieff TransTM Liposomal Transfection Reagent 脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑 | 40802ES03 | 1 mL |
HB220325
