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參考價(jià): | 面議 |
- 40306ES20 產(chǎn)品型號(hào)
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問(wèn)次數(shù):6623更新時(shí)間:2022-11-07 15:23:21
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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20T |
---|---|---|---|
貨號(hào) | 40306ES20 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 |
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC)
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | 儲(chǔ)存 | 價(jià)格元 |
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC) | 40306ES20 | 20T | -20oC | 988.00 |
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC) | 40306ES50 | 50T | -20oC | 1988.00 |
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC) | 40306ES60 | 100T | -20oC | 3198.00 |
產(chǎn)品描述
細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí),會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶,這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè),可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。
TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC)可以用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡晚期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的作用下,在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3′-羥基(3′-OH)末端摻入FITC-12-dUTP,從而可以用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
本試劑盒對(duì)標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化,采用*比例的FITC-12-dUTP和未標(biāo)記dNTP進(jìn)行3’-OH末端的核苷酸摻入,使得同一個(gè)斷裂的DNA片段末端可以形成更長(zhǎng)的“標(biāo)記尾巴"。該“標(biāo)記尾巴"減少了相鄰摻入dNTP上標(biāo)記基團(tuán)的空間位阻,增加每個(gè)斷裂片段上的熒光基團(tuán)數(shù)目,降低熒光基團(tuán)相鄰后可能造成的聚集和淬滅,從而提高檢測(cè)靈敏度,減少非特異性反應(yīng)。
本試劑盒應(yīng)用范圍廣,可以用于檢測(cè)冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況,也可以檢測(cè)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。
產(chǎn)品組分
編號(hào) | 組分 | 產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格 | ||
40306ES20(20T) | 40306ES50(50T) | 40306ES60(100T) | ||
40306-A | 5×Equilibration Buffer | 750μl | 1.25 ml×2 | 1.25 ml×3 |
40306-B | FITC-12-dUTP Labeling Mix | 100 μl | 250 μl | 250 μl×2 |
40306-C | Recombinant TdT Enzyme | 20 μl | 50 μl | 50 μl×2 |
40306-D | Proteinase K (2 mg/ml) | 40 μl | 100 μl | 100 μl×2 |
40306-E | DNase I (1 U/μl) | 5μl | 12.5μl | 25μl |
40306-F | 10 × DNase I Buffer | 100 μl | 250μl | 500μl |
運(yùn)輸與保存方法
冰袋(wet ice)運(yùn)輸。
本試劑盒儲(chǔ)存在-20℃,F(xiàn)ITC-12-dUTP Labling Mix避光儲(chǔ)存于-20℃,保質(zhì)期為一年。
注意事項(xiàng)
1)需自備用于洗滌細(xì)胞的PBS,用于封片的抗熒光淬滅封片液,用于固定的4%多聚甲醛。
2)為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
操作步驟
一、樣品準(zhǔn)備
A. 石蠟包埋組織切片
1)室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5min,重復(fù)一次,以*脫掉石蠟。
2)室溫下用100%乙醇浸泡切片5min,重復(fù)一次。
3)室溫下用梯度乙醇(90、80、70%)各浸洗1次,每次3min。
4)用PBS輕輕潤(rùn)洗切片,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周?chē)嘤嗟囊后w。這時(shí),可用石蠟筆或疏水筆在樣品周?chē)枥L樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。
5) 配制Proteinase K工作液:按1:100的比例,用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,使其終濃度為20μg/ml。
6)每個(gè)樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液,使其被全部覆蓋,室溫孵育20min。
【注】:Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),過(guò)短則可能造成透性處理不充分,影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。
7)用PBS溶液潤(rùn)洗樣本,輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤(rùn)。
B. 組織冰凍切片
1)將玻片浸沒(méi)在4%多聚甲\醛溶液(溶于PBS)中固定,室溫下孵育15min。
2)輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周?chē)嘤嗟囊后w。
3)將玻片浸沒(méi)在PBS溶液中,室溫孵育15min。
4)輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周?chē)嘤嗟囊后w。這時(shí),可用石蠟筆或疏水筆在樣品周?chē)枥L樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。
5) 配制Proteinase K工作液:按1:100的比例,用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,使其終濃度為20μg/ml。
6)每個(gè)樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液,使其被全部覆蓋,室溫孵育10min。
【注】:Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),過(guò)短則可能造成透性處理不充分,影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。
7)用PBS溶液潤(rùn)洗樣本2-3次。
8)輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤(rùn)。
C. 細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備
在Lab-Tek載玻片小室(Chamber Slides)上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。在凋亡誘導(dǎo)處理之后,用PBS洗2遍載玻片。
D. 細(xì)胞涂片的制備
1)準(zhǔn)備多聚賴(lài)氨酸包被的載玻片:吸取50–100 μl 0.01% (w/v)多聚賴(lài)氨酸水溶液,滴至每一片預(yù)清洗過(guò)的玻璃載玻片的表面。在將要用于固定細(xì)胞的區(qū)域?qū)⒍嗑圪?lài)氨酸溶液涂散為一薄層。待載玻片晾干之后,迅速用去離子水漂洗,然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干30-60 min。包被后的載玻片能在室溫儲(chǔ)存數(shù)月。
2)以約2×107個(gè)細(xì)胞/ml的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中,吸取50-100μl細(xì)胞懸液滴于多聚賴(lài)氨酸包被的載玻片上,用一片干凈的載玻片輕柔的涂開(kāi)細(xì)胞懸液。
3)固定細(xì)胞,將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,在4℃放置25min。
4)洗滌載玻片,將其浸入PBS中,室溫放置5min。重復(fù)用PBS洗一次。
5)輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周?chē)嘤嗟囊后w。這時(shí),可用石蠟筆或指甲油在樣品周?chē)枥L樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。
6) 配制Proteinase K工作液:按1:100的比例,用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,使其終濃度為20μg/ml。
7)每個(gè)樣本上滴加100μl上述Proteinase K溶液,使其被全部覆蓋,室溫孵育5min(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中,室溫孵育5min進(jìn)行通透處理)。
【注】:Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),過(guò)短則可能造成透性處理不充分,影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。
8)在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2-3次。
9)輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤(rùn)。
二、DNA酶處理陽(yáng)性對(duì)照的步驟(可選)
在樣本通透處理后,用DNA酶I處理細(xì)胞來(lái)準(zhǔn)備陽(yáng)性對(duì)照載玻片。該流程通常會(huì)引起被處理的大多數(shù)細(xì)胞顯現(xiàn)綠色熒光。
【注】:DNA酶I處理固定的細(xì)胞會(huì)引起染色體DNA的斷裂,產(chǎn)生許多可標(biāo)記的DNA 3’-末端。
1) 按1:10的比例用去離子水稀釋10×DNase I Buffer(每個(gè)樣本需用200 µl 1×DNase I Buffer,即需要用20µl 10×DNase I Buffer和180 µl去離子水混合稀釋),取其中100 µl滴加到已通透的樣本上,室溫孵育5min。 向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I (1U/μl),使其終濃度為10 U/ml。輕叩掉液體,加入100μl含5.5-10 units/ml DNase I的緩沖液,室溫孵育10min。
2)輕輕叩掉液體,加入100μl含10U/ml DNase I 的緩沖液,室溫孵育10min。
3)輕叩載玻片,去掉多余的液體,并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次。
【注】:陽(yáng)性對(duì)照載玻片必須使用單獨(dú)的染色缸,否則陽(yáng)性對(duì)照載玻片上殘余的DNase I 可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)載玻片上引入高背景。
三、標(biāo)記與檢測(cè)
1)按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer。
2)每個(gè)樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域,室溫孵育10-30分鐘。或者將載玻片放入一個(gè)含有 1×Equilibration Buffer的缸中,保證緩沖液沒(méi)過(guò)樣本。在平衡細(xì)胞的同時(shí)在冰上解凍FITC-12-dUTP Labling Mix,并且依照表1,準(zhǔn)備足夠量的用于所有實(shí)驗(yàn)的和可選陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對(duì)于面積小于5cm2的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng),其體積是50μl,用50μl乘以實(shí)驗(yàn)和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的數(shù)目來(lái)確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對(duì)于表面積更大的樣本,可成比例的增大試劑體積。
表1. 準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)的和可選陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液
組分 | 體積(μl/50μl體系) |
ddH2O | 34 |
5×Equilibration Buffer | 10 |
FITC-12-dUTP Labling Mix | 5 |
Recombinant TdT Enzyme | 1 |
陰性對(duì)照體系:準(zhǔn)備一份不含TdT酶的對(duì)照孵育緩沖液,用ddH2O替代TdT酶。
3)在平衡后的區(qū)域周?chē)梦埾吹?00μl 1×Equilibration Buffer中的大部分,然后在5cm2面積的細(xì)胞上加入50μl TdT孵育緩沖液。不要讓細(xì)胞干掉。這之后的操作,載玻片要避光。
4)把塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞上以保證試劑的平均分布,在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內(nèi),在37℃孵育60min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光。
【注】:塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。
5)移除塑料蓋玻片,并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5min。
6)輕輕去掉多余液體,換用新鮮的PBS溶液室溫孵育5 min,重復(fù)一次。
7) 用濾紙輕輕擦掉樣本周?chē)氨趁娴腜BS溶液。注意:為了降低背景,載玻片在用PBS洗一遍后,可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次,每次5min,這樣可將游離的未反應(yīng)標(biāo)記物清除干凈。
8) 樣本在染色缸中染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液(1μg/ml,用PBS新鮮配制并稀釋?zhuān)?/span>的染色缸,室溫放置5min。可選操作:樣本在染色缸中染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液(2μg/ml,用PBS新鮮配制并稀釋?zhuān)┑娜旧祝覝胤胖?min。
9)洗滌樣本,將載玻片浸入去離子水中,室溫放置5min,重復(fù)2次,總共洗3次。
10)叩干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細(xì)胞周邊的區(qū)域。
11)立即在熒光顯微鏡下分析樣本,用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過(guò)濾裝置在520±20nm的熒光下觀察綠色熒光;在>620nm下觀察PI的紅色熒光,或在460nm觀察藍(lán)色的DAPI。如有必要,載玻片能在4℃黑暗條件下存放一個(gè)晚上。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。
四、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)懸浮細(xì)胞
1)將3-5×106個(gè)細(xì)胞用PBS在4℃離心(300×g)洗兩次,然后重懸在0.5ml PBS中。
2)固定細(xì)胞,加入5ml 1%配制于PBS中的多聚甲\醛溶液,冰上放置20min。
3)細(xì)胞在4℃300×g離心10min,去上清并且重懸于5ml PBS。重復(fù)洗一次,并用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞。
4)通透細(xì)胞,加入5ml冰上預(yù)冷的70%乙醇,在-20℃孵育4小時(shí)。細(xì)胞能在70%乙醇中-20℃條件下保存一周,或者,細(xì)胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透,室溫放置5min。
5)細(xì)胞在300×g離心10min,并用5 ml PBS重懸。重復(fù)離心,并1ml PBS重懸。
6)轉(zhuǎn)移2×106個(gè)細(xì)胞至一個(gè)1.5ml的微量離心管。
7)300×g離心10min,去上清,并用80μl 1×Equilibration Buffer重懸。室溫孵育5min。
8)在平衡細(xì)胞的同時(shí),在冰上融解FITC-12-dUTP標(biāo)記混合物,并且依照表1,準(zhǔn)備足夠量的用于所有反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對(duì)于2×106個(gè)細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng),其體積是50μl,用50μl乘上反應(yīng)數(shù)目來(lái)確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。
9)細(xì)胞在300×g離心10min,去上清并把沉淀重懸在50μl TdT孵育緩沖液中,37℃孵育60min,避光。每隔15min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞。
10)加入1ml 20mM EDTA終止反應(yīng),用微量移液器輕柔混勻。
11)300×g離心10min,去上清并把沉淀重懸在1ml配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液,其中含5mg/ml BSA,重復(fù)一次,總共洗2次。
12)300×g離心10min,去上清并把細(xì)胞沉淀重懸在0.5ml PI溶液(5μg/ml)中,其中包含250μg 無(wú)DNA酶的Rnase A。
13)在黑暗中室溫孵育細(xì)胞30min。
14)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞,測(cè)量520±20nm的FITC-12-dUTP的綠色熒光和>620nm的PI紅色熒光。PI將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色,只在凋亡細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。
實(shí)驗(yàn)舉例(3T3-L cell)
陰性對(duì)照
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規(guī)格 | 價(jià)格(元) |
40306ES20 | TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC) | 20T | 1178.00 |
40306ES50 | TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC) | 50T | 2680.00 |
40306ES60 | TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC) | 100T | 4080.00 |
40307ES20 | TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 488) | 20T | 1250.00 |
40307ES50 | TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 488) | 50T | 3080.00 |
40307ES60 | TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 488) | 100T | 4800.00 |
40308ES20 | TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 647) | 20T | 1250.00 |
40308ES50 | TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 647) | 50T | 3080.00 |
40308ES60 | TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Alexa Fluor 647) | 100T | 4800.00 |