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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中會發(fā)出波長為560 nm左右的生物熒光，該螢光可通過化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測定。檢測原理如圖所示：

圖1：螢火蟲螢光素酶檢測原理圖

Luciferase Reporter Gene Assay kit是一閃光型螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒，具有靈敏度高的特點，可以高靈敏的檢測螢光素酶在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。

產(chǎn)品組分

運輸和保存方式

干冰運輸。-20℃保存，有效期1年。

試劑盒內(nèi)螢火蟲螢光素酶檢測試劑不能反復(fù)凍融，建議分裝-20℃或-80℃保存。

注意事項

1）檢測過程中需自備耗材和設(shè)備包括如下：PBS；100 μL移液器或者排槍；不透光白色酶標(biāo)板；Luminometer發(fā)光計、多功能酶標(biāo)儀或者其他能夠檢測生物發(fā)光的儀器；

2）反應(yīng)溫度：酶促反應(yīng)對溫度較為敏感，加樣檢測前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）再使用；

3）檢測儀器：能檢測化學(xué)發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同；

4）檢測設(shè)置：Luminescence，350-700 nm，建議檢測時間設(shè)為2-10 sec；

5）檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標(biāo)板。黑色酶標(biāo)板也可用，但因黑色會吸收光信號，可能會降低信號；

6）單管熒光測定儀測定，每個樣品與測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)保持一致；

7）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套；

8）本產(chǎn)品僅作科研用途！

實驗步驟

I.前處理

1.細(xì)胞

1）構(gòu)建相應(yīng)的載體。

2）轉(zhuǎn)染步驟請參照相關(guān)的說明書。

3）將細(xì)胞裂解液充分混勻，按如下方式加入細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞。

a: 對于貼壁細(xì)胞，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液，按照下表比例加入細(xì)胞裂解液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂解液*覆蓋細(xì)胞；

b: 對于懸浮細(xì)胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液。

冰上孵育5 min，充分裂解細(xì)胞。

【注】：裂解產(chǎn)物可室溫保存6 h；4℃保存16 h；-80℃可長期存放（裂解產(chǎn)物不能多次反復(fù)凍融），本試劑盒裂解液數(shù)量按照24孔板添加量進(jìn)行配制，如需要更多可單獨購買（CAT#11406）。

5）（選作）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

2.葉片組織（以煙草葉片為例，僅供參考）

1）構(gòu)建相應(yīng)的載體。

2）挑取轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到2 mL LB液體培養(yǎng)基（添加相應(yīng)抗生素）中，28℃ 220 rpm培養(yǎng)過夜。

3）農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600為1.0，1700× g離心5 min收集菌體后，用1/2MS液體培養(yǎng)基清洗菌體2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌的OD600調(diào)至1.0。

4）將待檢測的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行混合，使每種菌液的OD600為0.5。

5）選取生長期為1個月左右*伸展的煙草葉片，將混合好的菌液用1 mL注射器(去掉針頭)從煙草葉背面進(jìn)行注射。為保證實驗結(jié)果的一致性，需要將對照載體和待檢測目標(biāo)載體的菌液注射在同一葉片的不同部位上, 以保證相同的生長背景。

6）正常溫室生長條件下，24-48 h即可取樣觀察。

7）取3-4片直徑為6-8 mm的葉盤，放入2 mL的 EP 管（提前放入3-4個小鋼珠）中，液氮中冷凍，使用破碎儀進(jìn)行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎*后在EP管中加入100 μL裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解葉片。

9）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

3.原生質(zhì)體（僅供參考）

構(gòu)建相應(yīng)的載體。

制備原生質(zhì)體（參考相關(guān)文獻(xiàn)：Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565–1572）。

在2 mL EP管中加入相應(yīng)的載體（加入量需要摸索），加入100 μL原生質(zhì)體懸浮液。輕搖混勻后，加入110 μL PEG-CaCl2溶液，輕彈混勻。在室溫放置10-15 min。

4）加入440 μL W5溶液，上下顛倒以停止轉(zhuǎn)化。

5）200× g 室溫離心5 min，棄去上清，加入800 μL WI溶液重懸原生質(zhì)體。

室溫避光培養(yǎng)16-24 h。

7）將原生質(zhì)體加入2 mL離心管中，離心收集原生質(zhì)體，加入100 μL左右的裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解原生質(zhì)體。

9）（選做）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

II.熒光檢測

1）按照儀器說明書要求將熒光測定儀打開，設(shè)定參數(shù)，測定時間為10 sec，測定間隔為2 sec。

2）取20 μL裂解液加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致），另外加入100 μL螢火蟲螢光素酶檢測試劑，震板混勻

2-3次，充分混勻后測定RLU（Relative light unit）。

3）分析數(shù)據(jù)。

①實驗設(shè)計：根據(jù)不同實驗?zāi)康?，在每個培養(yǎng)板中都應(yīng)設(shè)置對照組、實驗組和空白對照組。為了保證實驗準(zhǔn)確性，理論上每個實驗組（包括對照組）都應(yīng)當(dāng)減去空白對照組的螢火蟲螢光素酶的發(fā)光測量值。

a.空白對照組：

背景F：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

注：空白對照組的樣品量必須與實驗樣品量相同，包含與實驗樣品相同的培養(yǎng)基/血清組合，并加上*相同的檢測試劑。

b.實驗組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)實驗化合物處理(即實驗組F)。

c.對照組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞不經(jīng)處理，用以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(即對照組F)。

②計算結(jié)果：

實驗組=實驗組F-背景F。

對照組=對照組F-背景F。

表達(dá)倍數(shù)=實驗組/對照組。

相關(guān)產(chǎn)品

 HB220325