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免疫親和純化有那三個(gè)主要影響因素
閱讀：1169 發(fā)布時(shí)間：2013-8-5免疫親和純化有那三個(gè)主要影響因素
影響免疫親和純化的因素有多種，其中zui關(guān)鍵的3個(gè)因素是：抗原zui初的純度原與抗體的親和力以及抗原抗體結(jié)合是否容易發(fā)生解離。
*大因素：哪種抗原相對(duì)容易被洗脫。這*由抗原—抗體相互作用的結(jié)合鍵的類型和數(shù)量來(lái)決定，因此這與抗體的親和力有關(guān)。然而親和力并不決定抗原是否容易洗脫。用于免疫親和純化的理想抗體是對(duì)抗原具有高親和力，與抗原的結(jié)合可被一種易于操作的簡(jiǎn)單而且溫和的方法如pH值的改變而逆轉(zhuǎn)。這些操作的設(shè)計(jì)將在后文闡述。在設(shè)計(jì)免疫親和純化的方法時(shí)，通常認(rèn)為zui重要的是選擇抗體和洗脫條件，在數(shù)種不同的洗脫條件下測(cè)試若干份有潛在使用價(jià)值的抗體，可發(fā)現(xiàn)高親和力與容易洗脫的優(yōu)化組合。
第二大因素：在免疫親和純化技術(shù)中，抗原zui初的相對(duì)濃度是決定zui終產(chǎn)物純度極為重要的因素，因?yàn)榭乖豢贵w的反應(yīng)具有相當(dāng)高的特異性，故而沒(méi)有任何其他層析技術(shù)能經(jīng)過(guò)一步純化得到如此高的純度。然而，純化的程度不是無(wú)限的，因?yàn)槭褂糜H和層析柱亦有某些內(nèi)在的背景限制，常規(guī)純化可以達(dá)到1000倍，大多數(shù)純化可達(dá)10 000倍。如果所研究的蛋白質(zhì)抗原非常，免疫親和純化必須與其他方法結(jié)合，才能獲得均質(zhì)性產(chǎn)物，這可以在免疫親和層析之前或其后采用其他的純化步驟來(lái)完成。常用的方法是在進(jìn)行免疫親和層析之前先將樣品通過(guò)一種或多種標(biāo)準(zhǔn)層析柱。還可將免疫親和層析純化的產(chǎn)物先經(jīng)過(guò)SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)印到膜上進(jìn)行微量測(cè)序。上述各種樣品，由于已通過(guò)用其他方法增加其總純度，再進(jìn)行免疫親和層析即可達(dá)到純化。
第三大因素：抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親和力是免疫親合純化法遇到的zui麻煩的問(wèn)題，抗體的親和力將決定從含抗原的溶液中提取抗原的總量，高親和力的抗體（>108mol／L）能在1h以內(nèi)達(dá)到有效地分離；而低親和力的抗體（106mol／L）即使在高濃度時(shí)也不能結(jié)合溶液中的全部抗原。值得注意的是，免疫親和純化達(dá)到平衡所需的總時(shí)間比其他方法如免疫沉淀顯著延長(zhǎng)，因?yàn)榭贵w是結(jié)合到固相支持物上，這樣就大大減慢了結(jié)合速度。由此亦可采用其他更有效的免疫化學(xué)技術(shù)來(lái)捕捉抗原，如使用多克隆抗體來(lái)識(shí)別同一抗原上的多個(gè)表位，但這種方法對(duì)大多數(shù)免疫親和純化并不適合。正如預(yù)期的那樣，通過(guò)這些方法增強(qiáng)親和力可結(jié)合較多的抗原，但是在洗脫抗原時(shí)，也會(huì)遇到很多始料不及的問(wèn)題。如果zui終的目的是純化保持原有特性的蛋白，那么只能選擇識(shí)別1個(gè)表位或1個(gè)短肽序列的抗體。只有當(dāng)所需的zui終產(chǎn)物為變性蛋白時(shí)，才選用識(shí)別多個(gè)表位的抗體。
在設(shè)計(jì)免疫親和純化的實(shí)驗(yàn)中，常見的錯(cuò)誤是將低親和力和容易洗脫等同看待。盡管這在某些低親和力抗體的應(yīng)用上得到證實(shí)，但通常并非總是如此，連接抗原與抗體的結(jié)合鍵，在高親和力和低親和力抗體都是同一類型（第二章）。例如，高親和力和低親和力的抗體都可通過(guò)鹽橋和抗原結(jié)合，并且是疏水作用。在這兩種情況下洗脫抗原都需要將結(jié)合鍵破壞，因此，選擇洗脫條件就存在相同的問(wèn)題。此外，低親和力抗體還會(huì)帶來(lái)新的問(wèn)題，包括結(jié)合容量低；在洗脫時(shí)，連續(xù)不斷從層析柱中濾去抗原，形成一個(gè)較為平坦的峰，而不是陡峭的洗脫峰。
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