化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
糖基化分析技術(shù)
閱讀：397 發(fā)布時(shí)間：2024-8-16當(dāng)碳水化合物以共有序列天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸連接到天冬酰胺上時(shí)，就會(huì)發(fā)生N-糖基化，其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸。當(dāng)表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成時(shí)，發(fā)生了預(yù)先形成的脂質(zhì)固定保守聚糖的整體轉(zhuǎn)移。當(dāng)合成的蛋白質(zhì)通過(guò)高爾基體進(jìn)入時(shí)，保守的N-連接的glyan被酶（糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶）“加工"。這些加工酶的存在，它們的相對(duì)水平以及蛋白質(zhì)上糖基化位點(diǎn)對(duì)這些酶的可及性決定了蛋白質(zhì)的最終糖基化類(lèi)型。O-糖基化發(fā)生在氨基酸絲氨酸和蘇氨酸上，但不符合線性共有序列。有一些控制該過(guò)程的規(guī)則，如：糖基化區(qū)域內(nèi)經(jīng)常有附近的脯氨酸氨基酸，絲氨酸和茶氨酸的串聯(lián)重復(fù)很常見(jiàn)。
一、N-聚糖
分析N-聚糖分析是最-活躍的研究領(lǐng)域。適用于N-糖基化分析的技術(shù)也適用于O-糖基化。哺乳動(dòng)物中最-豐富的N-聚糖結(jié)構(gòu)是復(fù)雜類(lèi)型，其中許多N-乙酰氨基葡糖結(jié)構(gòu)被附加到分子上，并與半乳糖，巖藻糖和唾液酸殘基一起延伸，形成兩個(gè)至四個(gè)觸角結(jié)構(gòu)。確切的結(jié)構(gòu)反映了表達(dá)過(guò)程中所用細(xì)胞類(lèi)型中存在的酶的性質(zhì)，以及細(xì)胞所處的精確環(huán)境。國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）質(zhì)量指南Q6B描述了應(yīng)針對(duì)這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行的分析類(lèi)型，以了解存在的不同類(lèi)型單糖的量，聚糖的觸角分布特性和連接性每個(gè)結(jié)構(gòu)中的單糖含量，以及蛋白質(zhì)骨架上不同糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)。
二、詳細(xì)信息的分析過(guò)程：
糖基化的分析涉及許多物理和酶促步驟，以釋放聚糖，然后將它們與肽和混合物中存在的任何O-糖肽分開(kāi)。O-聚糖可以從O-糖肽中化學(xué)釋放，并與其余肽鏈分開(kāi)純化。然后對(duì)分離的N-聚糖和O-聚糖進(jìn)行全甲基化衍生，使它們可以使用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法（MALDI-MS）分析。也可使用色譜分析樣品。如，帶有脈沖安培檢測(cè)（HPAEC-PAD）的高pH陰離子交換色譜法可用于分析N-聚糖。該法在三種制劑中提供了一致的數(shù)據(jù)，代表2、3和4個(gè)唾液酸化聚糖的一系列簇峰。該分析根據(jù)所產(chǎn)生的產(chǎn)物給出了一些結(jié)構(gòu)信息，而對(duì)于聚糖的確切性質(zhì)卻給出的信息很少。因此，像這樣的技術(shù)對(duì)于比較工作很有用，但沒(méi)有提供太多表征分子的結(jié)構(gòu)信息。
三、使用質(zhì)譜表征
前述的過(guò)甲基化方法允許在非衍生化狀態(tài)下分離具有相似質(zhì)量的聚糖。如：兩種聚糖-具有相同的結(jié)構(gòu)，除了一個(gè)包含一個(gè)N-乙酰神經(jīng)氨酸（唾液酸）殘基，另一個(gè)包含兩個(gè)巖藻糖殘基-在天然狀態(tài)下，分子量?jī)H相差1Da，但當(dāng)相差13Da時(shí)，具有相同的結(jié)構(gòu)衍生化。基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）分析可得出存在的聚糖的總體概況。使用光譜分析的峰（質(zhì)量），結(jié)合對(duì)N-聚糖，核心結(jié)構(gòu)和存在的生物合成途徑的了解，可以得出聚糖單糖的組成。
接下來(lái)，可使用電噴霧質(zhì)譜（ES-MS）裂解過(guò)甲基化的聚糖。斷裂路徑是明確定義的，根據(jù)斷裂發(fā)生的位置產(chǎn)生特定質(zhì)量。該過(guò)程取決于N-聚糖結(jié)構(gòu)的確切性質(zhì)，因此這些片段的質(zhì)量允許確定存在于聚糖上的觸角結(jié)構(gòu)。表征的最后一步是確定結(jié)構(gòu)中任何連接的立體特異性，其中數(shù)據(jù)表明可能存在潛在的免疫原性表位。用特定的糖苷外切酶處理聚糖并通過(guò)MS暴露前和暴露后進(jìn)行分析可以通過(guò)顯示孵育后的質(zhì)量轉(zhuǎn)移來(lái)確認(rèn)存在α-連接的半乳糖。
、針對(duì)以上技術(shù)資訊內(nèi)容，如果您有不太清楚或者了解更多信息(包括基本信息/技術(shù)資料/解決方案)，都可以隨時(shí)聯(lián)系我司業(yè)務(wù)員。我司提供的ELISA試劑盒種屬齊全，質(zhì)量有保障！提供全程技術(shù)指導(dǎo)及免費(fèi)代檢測(cè)服務(wù)。