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細(xì)胞因子免疫學(xué)檢驗(yàn)法之ELISA法
閱讀：885 發(fā)布時(shí)間：2023-12-27細(xì)胞因子多為多肽、蛋白或者糖蛋白，具備良好的抗原性，利用免疫學(xué)技術(shù)可以方便獲得不同細(xì)胞因子的抗血清、多克隆抗體或者單克隆抗體。細(xì)胞因子檢測(cè)無(wú)論是對(duì)免疫學(xué)、分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，還是對(duì)闡明某些疾病的發(fā)病機(jī)理，指導(dǎo)臨床治療均具有重要的意義。免疫學(xué)檢測(cè)法是細(xì)胞因子檢測(cè)常用的方法之一。
資料表明細(xì)胞因子與疾病的病理過(guò)程密切相關(guān)，細(xì)胞因子檢測(cè)及其基因表達(dá)狀況的測(cè)定正呈上升之勢(shì)。美迪西不僅可以為客戶提供基于Bio-Plex 200、流式CBA、MSD、Luminex系統(tǒng)等全面進(jìn)行各種single plex或multiplex的細(xì)胞因子檢測(cè)，還建立了一系列相關(guān)的免疫學(xué)檢測(cè)平臺(tái)，用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。
1、細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測(cè)法
酶聯(lián)免疫吸附法ELISA是一種特殊的試劑分析方法，它是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)，其試劑易于保存、結(jié)果判斷較為客觀，是目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗原抗體經(jīng)濟(jì)、普遍的試驗(yàn)診斷方法。ELISA法適用于測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿及組織液中的樣本，干擾小可以測(cè)到每毫升納克水平的細(xì)胞因子的水平。
ELISA基本原理是：
1）使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。
2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化頻率很高，故可放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
3）在測(cè)定時(shí)，將待測(cè)抗體（抗原）、酶標(biāo)抗原（抗體）與固相抗原（抗體）結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)洗滌使免疫復(fù)合物與待測(cè)抗體（抗原）呈比例，加入酶反應(yīng)物使其與固相上的酶反應(yīng)比那的，根據(jù)顏色做定性或定量分析，得出檢測(cè)結(jié)果。
2、細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）檢測(cè)法
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）檢測(cè)法是基于定量夾心ELISA法原理，將刺激后的細(xì)胞滴加到包被在貼PVDF微孔中，放置于37℃孵育。在孵育的過(guò)程中，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子即會(huì)被包被的抗體所捕獲，最后用不溶性的酶聯(lián)底物進(jìn)行顯色，每一個(gè)顯色點(diǎn)（斑點(diǎn)）代表一個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。通過(guò)專用的ELISPOT分析儀或在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，就可以進(jìn)行分析。
ELISPOT法可以在單細(xì)胞水平對(duì)細(xì)胞因子（CK）分泌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。由于是單細(xì)胞檢測(cè)，ELISPOT比ELISA具有更高的靈敏性，能從20萬(wàn)—30萬(wàn)細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。并且該方法綜合了普通ELISA方法的高特異性和準(zhǔn)確定量的優(yōu)點(diǎn)，而且具有生物活性分析得出與功能相關(guān)的結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。
3、細(xì)胞因子雙抗夾心ELISA檢測(cè)法
雙抗體夾心法需制備針對(duì)細(xì)胞因子不同位點(diǎn)的兩個(gè)單克隆抗體，先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，再用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出捕獲的抗原量。
該方法可用于抗原檢測(cè)，例如細(xì)胞因子、激素、蛋白質(zhì)、細(xì)菌和病毒等，是目前檢測(cè)抗原常用的ELISA方法。
4、細(xì)胞因子免疫印跡法Western Blot檢測(cè)法
Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞或者組織樣本中的蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后目標(biāo)蛋白與te有性一抗結(jié)合，再與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色，分析曝光條帶的位置和灰度分析獲知目標(biāo)蛋白在樣本中的表達(dá)情況。
Western Blot法結(jié)合了凝膠電泳和固相免疫測(cè)定兩種技術(shù)的高特異性和高敏感性，可以對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定型和半定量的分析。通過(guò)抗原抗體反應(yīng)對(duì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測(cè)，還可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后續(xù)分析。WB作為一種方便可靠的研究工具，將與譜和蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)一起在蛋白質(zhì)組時(shí)代發(fā)揮重要作用。由于細(xì)胞因子分子量比較小，有些用Western Blot進(jìn)行檢測(cè)不合適。
免疫學(xué)檢測(cè)法的主要特點(diǎn)是基于抗原抗體反應(yīng)，反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，大量商業(yè)化試劑盒也都是基于這種檢測(cè)方法。但是，由于僅僅基于分子間免疫學(xué)反應(yīng)，所測(cè)得細(xì)胞因子含量，并非等同于具備生物學(xué)活性的折疊正確的細(xì)胞因子，所以，在很多情況下需要借助于生物學(xué)檢測(cè)法最終確定細(xì)胞因子生物學(xué)活性。
細(xì)胞因子作為臨床和基礎(chǔ)研究的重要生物學(xué)分子和檢測(cè)指標(biāo)，其生物活性測(cè)定方法選擇的核心依據(jù)是該細(xì)胞因子與特定靶細(xì)胞在特定培養(yǎng)條件下的反應(yīng)性。結(jié)合免疫學(xué)方法對(duì)細(xì)胞因子含量的初步分析，并通過(guò)選取適當(dāng)?shù)捏w外細(xì)胞培養(yǎng)模型，我們才能獲得相對(duì)準(zhǔn)確的細(xì)胞因子的生物學(xué)活性指標(biāo)。
5、細(xì)胞因子免疫學(xué)檢驗(yàn)法常見(jiàn)問(wèn)題總結(jié)：
（1）ELISA 試 劑 盒 主 要 有 哪 些 試 劑 ？
ELISA 試劑盒中主要有
1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；
3）酶的底物；
4）標(biāo)準(zhǔn)品；
5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；
6）洗滌液；
7）酶反應(yīng)終止液。
（2）造成ELISA測(cè)定結(jié)果不正常的因素主要有：
1）標(biāo)本因素：樣本需新鮮采集，防止污染，且準(zhǔn)確稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)。
2）試劑因素：ELISA試劑盒在保質(zhì)期內(nèi)，其他試劑如蒸餾水的水質(zhì)等。
3）操作因素：注意操作細(xì)節(jié)，如加樣不可太快，避免加在孔壁上；洗板過(guò)程中注意洗液不能溢出孔外；顯色要注意控制時(shí)間等。
（3）ELISA 試劑盒（96 孔規(guī)格）一般可以進(jìn)行多少個(gè)樣本的檢測(cè)？
標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣本孔需進(jìn)行復(fù)孔操作以保證數(shù)據(jù)的可信度。每次需將標(biāo)準(zhǔn)品按照7-8個(gè)梯度稀釋以制備準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線。一次96孔板實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行20-25個(gè)樣本的檢測(cè)工作。
（4）抗體使用有哪些注意事項(xiàng)？
使用抗體前需仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，了解抗體的保存條件以及不同用途下的推薦稀釋比例。較高濃度的抗體（>0.5mg/mL）通常性質(zhì)更穩(wěn)定，受生產(chǎn)工藝和成本控制等因素影響，不同品牌的抗體的濃度也不相同，所以購(gòu)買(mǎi)時(shí)應(yīng)注意比較，經(jīng)驗(yàn)不足的實(shí)驗(yàn)者往往被抗體的體積迷惑，要注意相同質(zhì)量下低濃度的抗體體積反而更大。
（5）什么是WB的灰度半定量分析？
通常用Image J 或photoshop軟件對(duì)各個(gè)樣本的目的蛋白及其內(nèi)參蛋白曝光后膠片的灰度值進(jìn)行計(jì)算，按照灰度值的高低來(lái)半定量分析各個(gè)樣品中蛋白的表達(dá)差異。