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三、操作步驟（一）取材、冰凍切片：將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1MPBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1MPBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交玻片上，切片厚度為15-20μm。（二）探針制備與檢測（定量）：1.隨機(jī)引物制備cDNA核酸探針以DIGDNA標(biāo)記檢測試劑盒
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原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)（InsituHybridizationHistochemistry，ISHH）簡稱原位雜交（InSituHybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，
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DNA實驗技術(shù)：限制性內(nèi)切酶消化DNA實驗
標(biāo)簽：限制性內(nèi)切酶消化DNA影響限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。這種抑制可通過增加酶作用單位數(shù)、增大反應(yīng)體枳以稀釋可能的抑制劑或延長反應(yīng)時間來加以克服。實驗方法單酶單DNA樣品消化消化多個DNA部分消化實驗方法原理進(jìn)行限制酶切割反應(yīng)只需簡單地將酶和DNA樣品放在合適的反應(yīng)緩沖液溫育，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強(qiáng)度、溫育溫度和時間都依具體的反應(yīng)而改變。實驗材料DNA試劑、試劑盒TE酶切緩沖液EDTA儀器、耗材電泳儀實驗步驟1.混合下列溶液于一個無菌的微量離心管 -
斑點和狹線印跡是一種將混合的未經(jīng)分離的面定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上進(jìn)行雜交分析的簡單技術(shù)。用來檢測被印跡的1DNA制品中靶序列的相對豐度。實驗方法多樣抽濾法實驗材料DNA試劑、試劑盒SSCNaClNaOHTris·Cl儀器、耗材紫外透射儀電泳儀多樣抽濾加樣器實驗步驟1.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的尼龍膜，將膜置于6×SSC的表面讓其自然浸沒。放置10min。2.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的Whatman3MM濾紙，用6×SSC浸濕。3.將Whatman3MM濾紙置于多樣抽濾加樣器上，將膜
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DNA實驗技術(shù)：重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選
*節(jié)概述質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。如果要克隆較小的DNA片段（＜10kb）且結(jié)構(gòu)簡單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段,然后體外使兩者相連接,再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實際工作中,如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如 -
采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的粘末端進(jìn)行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應(yīng)溫度不同，這時可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進(jìn)行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應(yīng)要求，加入第二種酶進(jìn)行酶切；3）使用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切。具體要根據(jù)酶的反應(yīng)要求進(jìn)行，盡量避免星號活力。一材料、試劑和儀器：1材料：質(zhì)粒DNA
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甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）甲基化是目前的研究熱點，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享。希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?部分基因組DNA的提取。這一步?jīng)]有懸念，*可以購買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的。此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。使用兩者的細(xì)節(jié)：1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水
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一、原理：在濃氯化鈉（1―2mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化鈉（0.14mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。將抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，DNA或（RNA）即與蛋白質(zhì)分開，可用氯仿―異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇，DNA即析出。為了防止DNA或（RNA）酶解，提取時加入EDT
