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1 主題內(nèi)容與適用范圍

本文規(guī)定了食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法。

本文適用于航空食品的檢驗(yàn)。

2 設(shè)備和材料

吸管（1ml、10ml）、恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均質(zhì)器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡等

3 培養(yǎng)基和試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、EC肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面、色氨酸肉湯、MR-PV培養(yǎng)基、Korser氏枸掾酸鹽肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液、生理鹽水、革蘭氏染色液、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑、甲基紅指示劑、Voges-proskauer（V-P）試劑、

4 樣品制備

4.1 以無(wú)菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內(nèi)。如有包裝，則用75%乙醇在包裝開(kāi)口處擦拭后取樣。

4.2 制備樣品勻液

以無(wú)菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1-2min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質(zhì)時(shí)間超過(guò)2min，應(yīng)在均質(zhì)杯外加冰水冷卻。

4.3 稀釋樣品勻液

用10ml滅菌吸管準(zhǔn)確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有90ml稀釋劑的150ml稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。

5 大腸菌群的測(cè)定

5.1 大腸菌群MPN值的測(cè)定

5.1.1 對(duì)每個(gè)樣品，選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯，每管接種1ml。

5.1.2 將接種管置于36±1℃的培養(yǎng)48±2h。

5.1.3 觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)一步作證實(shí)試驗(yàn)。

5.2 大腸菌群的證實(shí)試驗(yàn)

5.2.1 將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。

5.2.2 置BGLB肉湯管于36±1℃的培養(yǎng)48±2h。

5.2.3 記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。

5.2.4 結(jié)果報(bào)告：按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報(bào)告每克（毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。

6 糞大腸菌群測(cè)定

6.1 用接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。

6.2 將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入44.5±0.5℃水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h。水浴箱的水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面。應(yīng)以已知為44.5℃產(chǎn)氣陽(yáng)性的大腸桿菌和44.5℃不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

6.3 記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陰性。

6.4 結(jié)果報(bào)告：按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報(bào)告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。

7 大腸桿菌測(cè)定

7.1 將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)（EMB）平板，36±1℃的培養(yǎng)24±2h。

7.2 檢查平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。

7.3 如有典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落；如無(wú)典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，36±1℃的培養(yǎng)18-24h。

7.4 將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗(yàn)。

7.4.1 色氨酸肉湯：在36±1℃的培養(yǎng)24±2h后，加Kovacs氏試劑0.2-0.3ml，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。

7.4.2 MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃的培養(yǎng)48±2h后。以無(wú)菌操作移取培養(yǎng)物1ml至13mm*100mm試管中，加5%萘酚乙醇溶液0.6ml，40%氫氧化鉀溶液0.2ml和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h，如出現(xiàn)伊紅色，為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。

將 MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，若變黃色則為陰性反應(yīng)。

7.4.3 Korser氏枸掾酸鹽肉湯：于36±1℃的培養(yǎng)96h記錄有無(wú)生長(zhǎng)。

7.4.4 LST肉湯：于36±1℃的培養(yǎng)48±2h，觀察試管中是否產(chǎn)氣。

7.4.5 革蘭氏染色：取18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

7.4.6 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下

如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應(yīng)重新劃線分離，必要時(shí)做重復(fù)試驗(yàn)。

7.5 結(jié)果報(bào)告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗(yàn)為++--或-+--，再根據(jù)LST肉湯陽(yáng)性管數(shù)查MPN表，報(bào)告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。

注：本文參照SN0169-92《出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法》