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          上海北諾生物科技有限公司
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          專題：轉(zhuǎn)染實驗的注意事項
          2013-7-8　　閱讀(1424)
          

          
							
				
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          將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細胞中的方法主要有以下幾種：
          1.磷酸鈣共沉淀
          將氯化鈣，RNA（或DNA）和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因為甚至偏離*條件十分之一個pH都會導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。
          2.電穿孔法
          電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導(dǎo)沿細胞膜的電壓差異，據(jù)認為這種電壓差異會導(dǎo)致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。
          3.DEAE-葡聚糖和polybrene
          帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細胞表面。通過使用DMSO或獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖于瞬時轉(zhuǎn)染。
          4.機械法
          轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)或細胞核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導(dǎo)入細胞。
          5. 陽離子脂質(zhì)體試劑
          在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一個約5kb的質(zhì)粒會結(jié)合2-4個脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會被導(dǎo)入培養(yǎng)的細胞?，F(xiàn)存對DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體。
          6. 腺病毒載體
          腺病毒由于其基因結(jié)構(gòu)、功能清楚；易于制備、純化、濃縮；宿主范圍廣；感染率高；理化性質(zhì)穩(wěn)定；不整合宿主基因組；遺傳毒性和免疫毒性低的特點，成為RNA干擾實驗研究中重要的基因載體系統(tǒng)。Ad2和Ad5是目前應(yīng)用zui廣的兩種腺病毒血清型。
          為了達到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實驗過程中，需要注意以下幾點：
          1.純化siRNA
          在轉(zhuǎn)染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。
          2.避免RNA酶污染
          微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。
          3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性
          通常，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。
          4.避免使用抗生素
          Ambion公司推薦從細胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時期間避免使用抗生素?？股貢诖┩傅募毎蟹e累毒素。有些細胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到*轉(zhuǎn)染效果。
          5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑
          針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關(guān)重要。
          6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件
          對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細胞毒性以至死亡。
          7.通過標(biāo)記siRNA來優(yōu)化實驗
          熒光標(biāo)記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實驗（配合標(biāo)記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。 
          
      
          
      
      
          
    
          
    
          
  
          

          
		 







  
    
    				
			 
    
    

    

     
      
     
	 

 	
	
	


          
	
          
		
          
			
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