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2． 熒光標(biāo)記的抗體應(yīng)該避光保存在4℃，不要冷凍；
3． 當(dāng)染色的時候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結(jié)果，染色后應(yīng)該馬上分析。
1． 制作外周血、淋巴組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；
2． 細(xì)胞染色抗體（包括直接標(biāo)記抗體和間接標(biāo)記抗體）；
注意：流式細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化都很重要。關(guān)鍵參數(shù)包括靶細(xì)胞、抗體效價以及動力學(xué)。
材料：12×75 mm的圓底試管（Falcon Cat.No.2008）或96孔圓底微量滴定板（Falcon Cat.No.3910），原始抗體（既未純化也未偶聯(lián)），
緩沖液： eBioscience流式染色緩沖液（Cat.No.00-4222），流式鞘液
半個小時細(xì)胞準(zhǔn)備，半個小時抗體稀釋和樣品準(zhǔn)備，半個小時到一個小時孵育過程，半個小時以上的運(yùn)行和分析時間
1． 采集組織（脾，淋巴結(jié)，胸腺），用注射器的活塞擠壓以制成單細(xì)胞懸液，此過程用10ml的染色緩沖液；
2． 轉(zhuǎn)移到50ml的圓錐形試管中并使大塊沉淀到試管底部或者通過尼龍濾網(wǎng)過濾，得到單細(xì)胞懸液；
3． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清；
4． 如果上過程采集的脾，還用用RBC裂解，否則進(jìn)入下一步；
5． 用50ml染色液重懸樣本，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和活力分析；
6． 再次離心細(xì)胞，棄掉上清，重懸細(xì)胞使其細(xì)胞數(shù)達(dá)到2×107 個/ml；
1． 用50 ?l染色液稀釋前面選的抗體，分裝到每個試管或微量滴定板的孔中。吸取50 ?l染色液到陰性對照試管中。在滴定實(shí)驗(yàn)中，滴定范圍是2-0.03?g/百萬個細(xì)胞；
2． 加入50 ?l細(xì)胞懸液（相當(dāng)于106個細(xì)胞）于每個試管或孔中，輕輕混勻；
3． 避光冰浴20分鐘。注意：某些抗體可能需要更長的孵育時間，用預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索實(shí)驗(yàn)條件；
4． 孵育之后，加入染色液（試管2ml，微量滴定板200?l）；
5． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞5分鐘（300-400g），吸掉上清；
7． 重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，到流式細(xì)胞儀上分析。
a.如果用熒光標(biāo)記的抗體，用500 ?l染色液重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，然后在流式細(xì)胞儀上分析。
注意：如果同時加入多種熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，孵育和洗滌的步驟和上面的一樣。注意加入熒光抗體后的所有步驟都要在低溫避光的條件下進(jìn)行。
12×75 mm的試管（Falcon Cat.No.2008）
eBioscience 流式染色液（Cat.No.00-4222）
eBioscience 1×RBC Lysis Buffer（Cat.No.00-4333）
流式儀試驗(yàn)時間半個小時抗體稀釋和樣品準(zhǔn)備半個小時到一個小時染色過程半個小時以上的運(yùn)行和分析時間方法
3． 避光室溫孵育15-30分鐘。注意：某些抗體結(jié)合力較低可能需要更長的孵育時間。預(yù)試驗(yàn)摸索這些條件。
4． 加2ml 1×RBC（預(yù)溫到室溫）于每個試管中，輕輕混勻；
5． 避光室溫孵育樣品10分鐘。用1×RBC 孵育不要超過15分鐘。
6． 室溫離心樣品（300-400g），抽吸掉上清液，然后用2ml 染色液洗一次。
7． 重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，然后在流式細(xì)胞儀上分析樣品。
a. .如果用熒光標(biāo)記的抗體，用500 ?l染色液重懸已染色的細(xì)胞沉淀物，然后在流式細(xì)胞儀上分析。
注意：如果同時加入多種熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，孵育和洗滌的步驟和上面的一樣。注意加入熒光抗體后的所有步驟都要在低溫避光的條件下進(jìn)行。
