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免疫組化基礎(chǔ)知識(shí)
●免疫組織化學(xué)的概念
是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry）或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（immunocytochemistry）。
●免疫組化的分類
免疫組織化學(xué)技術(shù)按照標(biāo)記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。
其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本zui常用、zui基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中的組織標(biāo)本制作方法。
免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。
多抗和單抗特性比較：
1.均一性。一種單抗中，每個(gè)抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和氨基酸順序都相同，只有一種Ig亞類。即單抗是一種純度很高的均一抗體。而從不同動(dòng)物，不同時(shí)期所得到的多抗，各有不同的化學(xué)組成。多抗是多種種類和亞類Ig的混合物。
2.穩(wěn)定性。單抗的穩(wěn)定性較差，對(duì)PH變化敏感，對(duì)熱不穩(wěn)定，提純過程中易變性，而多抗的穩(wěn)定性則較好。
3.特異性。單抗是單一地針對(duì)抗原的某一決定簇，所以用它進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)時(shí)，特異性強(qiáng)，敏感性高，一般不發(fā)生交叉反應(yīng)，而多抗能與抗原上的多種抗原決定簇結(jié)合，所以特異性較差，較易引起交叉反應(yīng)。
4.重復(fù)性。單抗的重復(fù)性好，而多抗每批都不一樣。
5.沉淀反應(yīng)。多抗由于與抗原多價(jià)結(jié)合容易形成網(wǎng)絡(luò)樣沉淀，而單抗只與抗原結(jié)合產(chǎn)生二聚體，不能直接形成抗原抗體沉淀物。
●免疫組化常用的染色方法
根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法zui常用。
●免疫組化操作步驟
一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ：
1．切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行
2. 緩沖液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。
4. 緩沖液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。
（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩沖液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時(shí)。（具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者zui終決定）
8. 緩沖液洗 5min/2 次。
9. 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增強(qiáng)子 ） , 在室溫下孵育 20 分鐘。
10.緩沖液洗 5min/2 次。
11.滴加 HRP Polymer（ 酶標(biāo)二抗 ） ，在室溫下孵育 30 分鐘。
（注： HRP Polymer 對(duì)光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。）
12.緩沖液洗 5min/2 次。
13．向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時(shí)間由染色深淺決定。）
14 ．自來(lái)水充分沖洗 , 復(fù)染，脫水 , 透明 , 封片。
二．免疫組化 （ 三步法 ） 操作步驟 ：
（ 1 ）石蠟切片脫蠟至水。
（ 2 ）3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
（ 3 ）蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）。
（ 4 ）5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時(shí)或 4 ℃ 過夜。
（ 5 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 6 ）滴加適量 生物素標(biāo)記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 7 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 8 ）滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 9 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 10 ）顯色劑顯色 3-15 分鐘（ DAB 或 NBT/BCIP ）
（ 11 ）自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。
三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：
冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ：
1．切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行
2. 緩沖液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。
4. 緩沖液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。
（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩沖液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時(shí)。（具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者zui終決定）
8. 緩沖液洗 5min/2 次。
9. 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增強(qiáng)子 ） , 在室溫下孵育 20 分鐘。
10.緩沖液洗 5min/2 次。
11.滴加 HRP Polymer（ 酶標(biāo)二抗 ） ，在室溫下孵育 30 分鐘。
（注： HRP Polymer 對(duì)光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。）
12.緩沖液洗 5min/2 次。
13．向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時(shí)間由染色深淺決定。）
14 ．自來(lái)水充分沖洗 , 復(fù)染，脫水 , 透明 , 封片。
二．免疫組化 （ 三步法 ） 操作步驟 ：
（ 1 ）石蠟切片脫蠟至水。
（ 2 ）3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
（ 3 ）蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）。
（ 4 ）5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時(shí)或 4 ℃ 過夜。
（ 5 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 6 ）滴加適量 生物素標(biāo)記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 7 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 8 ）滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 9 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 10 ）顯色劑顯色 3-15 分鐘（ DAB 或 NBT/BCIP ）
（ 11 ）自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。
三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：
冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，免疫組化技術(shù)服務(wù)主要涉及抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的描述與分析，圖片的確定與選取，相關(guān)數(shù)據(jù)的提供，上述工作是免疫組化工作的重點(diǎn)內(nèi)容，只有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作，專業(yè)化的結(jié)果分析才能更好的滿足客戶的要求，這點(diǎn)對(duì)于形式為腹水，上清，培養(yǎng)液之類的抗體顯得更為重要。關(guān)于上述服務(wù)內(nèi)容應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)開始前由雙方明確，一般而言，客戶方實(shí)驗(yàn)前應(yīng)提出需要什么樣的結(jié)果與分析，例如是簡(jiǎn)要還是詳細(xì)的描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)否，圖片的數(shù)量與規(guī)格等。如果為雙盲試驗(yàn)或有第三方參與，則事先申明。
●石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？
組織在制作過程中，由于化學(xué)試劑的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，致使在免疫組化的染色過程中不能將其顯示出來(lái)，為了解決上述的問題，利用化學(xué)試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來(lái)或修正過來(lái)的過程稱為抗原修復(fù)。
常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是PH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是PH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
近年來(lái)，隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規(guī)腫瘤病理診斷中，5%-10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學(xué)診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實(shí)用價(jià)值受到了普遍的認(rèn)可，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時(shí)，準(zhǔn)確率可達(dá)50%-75%。
免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面：
（1）惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；
（2）確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；
（3）對(duì)某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型；
（4）軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時(shí)難以區(qū)分其組織來(lái)源，應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對(duì)軟組織腫瘤的診斷是*的；
（5）發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。
（6）為臨床提供治療方案的選擇。
（5）發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。
（6）為臨床提供治療方案的選擇。
