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酶聯(lián)免疫吸附ELISA實(shí)驗(yàn)檢測目的抗原方法講解
閱讀：50 發(fā)布時間：2024-11-13 ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)是一種廣泛應(yīng)用在測定液體樣本中的蛋白、抗體、或激素的免疫分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序，通常是把蛋白、抗體、或激素等（即抗原）直接或是以捕捉抗體（capture Ab）固定在固相載體上，再加入一級檢測抗體（primarydetection Ab），形成一個抗原抗體的復(fù)合物。如果該抗體已經(jīng)用酶（enzyme）標(biāo)記了，即可用來直接測定抗原的量，若無，則可利用另一個酶標(biāo)記的二級抗體來測定抗原的量。測定抗原量的方法是加入該酶的底質(zhì)（substrate），作用后產(chǎn)生出現(xiàn)的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關(guān)系，依此原理計(jì)算出樣本中的抗原總量或濃度。ELISA生物試驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。
ELISA的主要原理：
1、包被 抗原或者抗體能以物理性吸附于固相載體表面，可能原理是蛋白質(zhì)和聚苯C2H4表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗體反應(yīng)等免疫活性；
2、標(biāo)記 抗原或者抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特點(diǎn)；
3、顯色 酶結(jié)合物與相應(yīng)包被在固相載體的抗原或者抗體結(jié)合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現(xiàn)顯色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的顏色深淺可計(jì)算抗原或者抗體的相對含量。
一、ELISA雙抗夾心法
雙抗夾心法針對至少2個抗原決定簇的多價(jià)抗原。首先介紹一下抗原決定簇，抗原決定簇就是決定抗原性的特殊化學(xué)基團(tuán)，也叫抗原表位，理論上一個抗原決定簇能誘導(dǎo)產(chǎn)生一種單克隆抗體（可能有童鞋又要問單克隆抗體是神馬東東了，以后介紹?。Ｓ?/span>6－12氨基酸或碳水基團(tuán)組成，它可以是由連續(xù)序列（線性表位）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)（構(gòu)象表位）組成。臨床上具有2個抗原決定簇的多價(jià)抗原有很多，比較常見有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。檢測步驟也簡單，就是包被、洗滌、加樣、洗滌、加樣、洗滌、顯色。具體說來是先將純化的相應(yīng)抗體包被在固相載體上，再加入待測樣品，若其中含有待測抗原就會與固相抗體結(jié)合，洗掉雜質(zhì)后，再加入酶標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗掉多于的酶標(biāo)抗體后，加入底物顯色，顯色與否以及顏色的深淺就代表了待測抗原是否存在以及相對含量了。
對于雙抗夾心法檢測大分子抗原要注意幾點(diǎn)：
1.固相抗體和酶標(biāo)檢測抗體一定是分別針對待測抗原的兩個不同抗原決定簇，不然兩個抗體就會為爭同一個決定簇而打架，會出現(xiàn)假陰性的不良結(jié)果；
2.如果檢測的樣本是血清，就要注意風(fēng)濕病患者體內(nèi)內(nèi)風(fēng)濕因子RF這種奇葩異種抗體的存在，它能夠神奇地結(jié)合固相抗體和檢測抗體，造成假陽性的不良結(jié)果；
3.包被的固相抗體含量一定是高于樣品中的抗原含量，不然檢測到的含量會比實(shí)際含量低；
4.如果想省事一些，將待測樣品與酶標(biāo)檢測抗體同時加入固相載體，在酶標(biāo)檢測抗體高于樣品中的待測抗原的情況下，會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這種現(xiàn)象書本叫鉤狀效應(yīng)。
競爭法針對小分子抗原。這種方法也可以用于大分子抗原，只是相對雙抗夾心法這種強(qiáng)悍的策略，競爭法全沒有優(yōu)勢，所以競爭法只在檢測小分子這個邊緣地帶發(fā)揮余熱了。臨床上主要用于T3、T4、孕酮等激素以及藥物等。檢測步驟與雙抗夾心法更簡單，包被、洗滌、加樣、洗滌、顯色，少了一步加樣的過程，但是設(shè)計(jì)上復(fù)雜一些，首先將純化的相應(yīng)抗體包被在固相載體上，然后每組樣本需要分兩組，一組同時加入事先混勻好的酶標(biāo)檢測抗原和樣本的混合物，一組只加入酶標(biāo)記抗原，兩組顏色只差便是待測抗原的含量。
對于競爭法也需要注意一點(diǎn)，酶標(biāo)記抗原和待測樣本一定要事先混勻好，然后同時加入固相載體，不然會造成bu公平競爭，檢測出現(xiàn)偏差。
利用干擾實(shí)驗(yàn)即可辨別ELISA試劑盒是否檢測目的抗原，方法如下：
1、將針對試劑盒特異性的重組蛋白抗原和試劑盒中的檢測抗體配置成antibody: antigen≈1:2的混合孵育液；
2、37℃孵育15分鐘后，代替原試劑盒中的檢測抗體；
3、后續(xù)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，加檢測抗體、酶復(fù)合物和底物
4、實(shí)驗(yàn)完畢后，檢測其標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果標(biāo)準(zhǔn)曲線良好則說明加入的目的抗原和試劑盒抗體不匹配，試劑盒檢測抗體針對的是非目的抗原，該試劑盒為偽劣假造elisa試劑盒。
5、如果標(biāo)準(zhǔn)曲線無線性，則說明試劑盒檢測抗體已被目的抗原中和或干擾，影響了其實(shí)際試劑盒抗體的檢測作用，則該試劑盒檢測抗體針對的是目的抗原。