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RNA提出取得的基本操作步驟
RNA的提出取得準(zhǔn)備試藥：氯仿，異丙醇，75酒精，無(wú)RNase的水或0.5SDS(溶液均需用DEPC處置過的水配合制造)
操作步驟：
1. 勻漿處置：
① 團(tuán)體 將團(tuán)體在液氮中磨碎，每50-100mg團(tuán)體參加1ml TRIzol，用勻漿儀施行勻漿處置。樣品大小不應(yīng)超過TRIzol大小10。
② 單層培育細(xì)胞 直接在培育板中參加TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2平面或物體表面的大小(即3.5cm直徑的培育板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)依據(jù)培育板平面或物體表面的大小而定，不決定于于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不充足有可能造成提出取得的RNA有DNA污染。
③ 細(xì)胞懸液 離心使聚在一起細(xì)胞，每5-10×106 動(dòng)物、植物、釀母菌細(xì)胞或1×107球菌細(xì)胞參加1ml TRIzol，反反復(fù)復(fù)吸打。加TRIzol之前不要蕩滌細(xì)胞免得mRNA降解。一點(diǎn)釀母菌和球菌細(xì)胞需用勻漿儀處置。
2. 將勻漿樣品在室溫(15-30℃)干燥箱安放5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物離合。
3. 可選步驟：如樣品中包括較多氨基酸，脂肪，多糖或胞外事物(肌肉，植物支節(jié)局部等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心獲得的沉淀中涵蓋細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中包括RNA。處置脂肪團(tuán)體時(shí)，領(lǐng)導(dǎo)有數(shù)量多油脂應(yīng)去除。取表白的勻漿液施行下一步操作。
4. 每運(yùn)用1ml TRIzol參加0.2ml氯仿，猛烈振動(dòng)15秒，室溫安放3分鐘。
5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，領(lǐng)導(dǎo)為無(wú)色水相和一個(gè)半中腰層。RNA主要在水相中，水相大小約為所用TRIzol試藥的60。
6. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要離合DNA和氨基酸可保存有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每運(yùn)用1ml TRIzol參加0.5ml異丙醇，室溫安放10分鐘。
7. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底顯露出來膠狀沉淀。移去上清。
8. 用75酒精蕩滌RNA沉淀。每運(yùn)用1ml TRIzol至少加1ml 75酒精。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。
9. 室溫安放干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心干燥，過于干燥會(huì)造成RNA的溶解性大大減低。參加25-200μl無(wú)RNase的水或0.5SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃安放10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反響，勿運(yùn)用SDS溶液。RNA也可用100的去離子甲酰胺溶解，-70℃保留。
常見問題剖析：
1. 得率低：
① 樣品裂解或勻漿處置不*
② RNA沉淀未溶解
A260/A280<1.65 ：
① 檢驗(yàn)測(cè)定吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子液體濃度和低pH值條件下A280值偏高
② 樣品勻漿時(shí)加的試藥量太少
③ 勻漿樣品時(shí)未在室溫安放5分鐘
④ 汲取水相時(shí)混入了有機(jī)相
⑤ RNA沉淀未溶解。
RNA降解：
① 團(tuán)體抽取后沒有立刻處置或冷凍
② 待提出取得RNA的樣品沒有保留于-60至-70℃，而保留在了-5至-20℃
③ 細(xì)胞在用胰酶處置時(shí)過度
④ 溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處置
⑤ 電泳時(shí)運(yùn)用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染：
① 樣品勻漿時(shí)加的試藥量太少
② 樣品中包括有機(jī)溶劑(如酒精，DMSO等)，強(qiáng)緩和沖突液或堿性溶液
蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的過程中作以下改進(jìn)可去除這些個(gè)污染，步驟7中，每運(yùn)用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙純和0.25ml高鹽溶液(0.8M寧檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心，按之前操作施行。這種辦法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出純RNA。從包括數(shù)量多多糖的植物中提出取得RNA時(shí)應(yīng)在勻漿后離心，并加上以指出操作步驟。
注意事情的項(xiàng)目：
1.自小量樣品(1-10mg團(tuán)體或102-104細(xì)胞)中提出取得RNA時(shí)可參加少量牲粉以增進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free牲粉。牲粉會(huì)與RNA一同沉淀出來，牲粉液體濃度不高于4mg/ml是不影響第1鏈的合成，也不影響PCR反響。
2．勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保留至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保留于75 乙醇中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分層和RNA沉淀時(shí)也可運(yùn)用臺(tái)式離心思，2600×g離心30-60分鐘。
預(yù)先期待產(chǎn)量：1mg團(tuán)體或1×106細(xì)胞提出取得RNA作別為：
肝和脾6-10μg，腰子3-4μg，橫紋肌和腦團(tuán)體1-1.5μg，臍帶1-4μg，上皮細(xì)胞8-15μg，成纖維細(xì)胞5-7μg 。