克倫特羅快速檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

一、原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物克倫特羅將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗克倫特羅抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物克倫特羅的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即可得出相應(yīng)殘留物克倫特羅的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度：  0.1ppb

孵育溫度： 25℃

孵育時(shí)間： 30min～15min

樣本檢測(cè)下限

尿 樣                                 0.1ppb

組 織（處理法一）                    0.4ppb

組 織（處理法二）                     0.1ppb

飼 料                                 1ppb

交叉反應(yīng)率

克倫特羅（Clenbuterol）                100%

特pu他林（Terbutalin）                  <1%

馬布特羅(Mabuterol)                    <1%

溴布特羅(Brombuterol)                  <1%

沙丁胺醇（Salbutamol ）               <1%

萊克多巴胺（Ractopamine）            <1%

樣本回收率

尿 樣                 95%±22%

組 織                 75%±20%

飼 料                 80%±20%

三、試劑盒組成  

  1 微量測(cè)試孔 每條 8 孔，一板 12 條

     標(biāo)準(zhǔn)液×6 瓶 0ppb 0.1ppb

2  0.3ppb 0.9ppb

 （1ml/瓶）  

  2.7ppb 8.1ppb

3 酶標(biāo)記物 7ml 紅色帽

4 抗體工作液 10ml 藍(lán)色帽

5 底物 A 液 7ml 白色帽

6 底物 B 液 7ml 黑色帽

7 終止液 7ml 黃色帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、打印機(jī)

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span> 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl

試 劑：乙酸乙酯、乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、

甲醇、無(wú)水硫酸鈉、正己烷

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本前處理需配制：

配液 1  0.1M HCl 溶液取 0.86ml 濃 HCl 加水定溶至 100ml。

配液 2  0.1M NaOH 溶液稱(chēng)取 0.4g NaOH 加水定溶至 100ml。

配液 3  乙腈-0.1M HCl 溶液V 乙腈：VHCl =84：16。

樣本處理：

（a）尿樣本的處理方法

取 20µl 清亮尿樣直接測(cè)定（如果尿樣渾濁一定要過(guò)濾或 4000r/min 離心 10min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。 3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于樣本稀釋倍數(shù):  1 倍 洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定

（b）組織樣本的處理方法一 程序中的要點(diǎn)。

1、稱(chēng) 2±0.05g 均質(zhì)后的組織至 50ml 離心管中，加 4、 所有恒溫孵育過(guò)程，避免光線(xiàn)照射，用蓋板膜入 6ml 去離子水，充分振蕩 2min，室溫 蓋住微孔板。

4000r/min 以上離心 10min(注：若組織樣本中油 u  操作步驟：

脂含量較高，可在振蕩后放入 85℃水浴 10min 1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～后再離心)； 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使

2、取 20µl 上層液進(jìn)行分析。 用前均須搖勻。

樣本稀釋倍數(shù):  4 倍 2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放

（c）組織樣本的處理方法二 入自封袋，保存于 2～8℃。

1、稱(chēng)取 2 ± 0.05g 均質(zhì)后的組織于 50ml 離心管 3、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每中，加入 6ml 乙腈-0.1MHCl，振蕩 2min,室溫 個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和

4000r/min 以上離心 10min； 樣本孔所在的位置。

2、取上清 3ml，加入 2ml 0.1M NaOH，加入 6ml 4、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 20µl/孔到各自的微孔中，然后加乙酸乙酯，振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上離 酶標(biāo)記物 50µl/孔，再加入 80µl/孔的抗體工作心 10min。取全部上清于 50～60℃氮?dú)饬骰蚩?液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境氣流吹干； 反應(yīng) 30min。

3、加入 1ml 去離子水溶解干燥后的殘留物，混合 5、將孔內(nèi)液體甩干，用去離子水 250µl/孔洗板 4～30s； 5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍

4、取 20 µl 用于分析。 干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

樣本稀釋倍數(shù)： 1 倍 6、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B

（d）飼料處理方法 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯

1、稱(chēng)1.0±0.05g 研碎的飼料樣品于50ml 離心管中， 色 15min。

加入 10ml 甲醇，再加入 5g 無(wú)水硫酸鈉，充分 7、測(cè)定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)振蕩 2min；15℃ 4000r/min 以上離心 10min； 定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長(zhǎng) 450/630n

2、吸出離心后的上清液 1ml，于 50～60℃氮?dú)饬?m 檢測(cè)，5min 內(nèi)讀數(shù)），測(cè)定每孔 OD 值?；蚩諝饬鞔蹈?，用 1 ml 去離子水溶解干燥后的 七、結(jié)果判定殘留物，再加入 1ml 正己烷混合 30s ；15℃ 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方4000r/min 以上離心 5min；去除上層有機(jī)相；

 法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與

3、取下層 20 µl 用于分析。

 其所含克倫特羅量成負(fù)相關(guān)。

 樣本稀釋倍數(shù)：10 1、粗略判定：

 六、酶標(biāo)免疫分析程序: 用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出

u   測(cè)定前應(yīng)須知： 其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：（20～25℃）。 0ppb 為 2.243； 0.1ppb 為 1.816；0.3ppb 為 1.415；

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。 0.9ppb 為 0.74；2.7ppb 為 0.313；8.1ppb 為 0.155。則樣本 1 的濃度范圍是 2.7ppb～8.1ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克倫特羅實(shí)際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以 100%，即B百分吸光率（%）＝ ×100%B0

（2）B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以克倫特羅標(biāo)

準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克倫特羅實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、注意事項(xiàng):

1、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。

2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒最jia反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

1、儲(chǔ)藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。

2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)放心使用。

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