2018-01 版

呋喃西林代謝物  快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物呋喃西林代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃西林代謝物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色， 樣本吸光值與其所含殘留物呋喃西林代謝物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃西林代謝物的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度： 0.02ppb

u 孵育溫度： 25℃

u 孵育時(shí)間： 30min~15min

u 樣本檢測下限

組  織 ·······································   0.1ppb

雞  蛋 ·······································   0.1ppb

u 交叉反應(yīng)率

呋喃西林代謝物 100%

呋喃唑酮代謝物 ＜0.1%

呋喃妥因代謝物 ＜0.1%

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請放心使用。

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋

微量移液器：單道 20~200µl、單道 100~1000µl、多道 30~300 µl

試 劑：氫氧化鈉、K₂HPO₄·3H₂O、正己烷、乙酸乙酯、濃 HCl

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a） 實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b） 實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈， 必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本前處理需配制

配液 1 0.1M K HPO 溶液：

2、 在 70℃水浴鍋中孵育 20min；

3、 分別加入 5ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液，0.4ml 1M NaOH 溶液和 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 30s；

4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min

（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足   3ml        ，在80      ℃  水浴孵育樣品10min      并重復(fù)離心；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時(shí)間重復(fù)離心）；

5、 取出 3ml 的乙酸乙酯到另一個(gè)容器中于 50℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。

6、 用 2ml 正己烷溶解干燥物，再加入 1ml 樣本復(fù)溶液充分混合 30s；在室溫下 4000r/min 以上離心    10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，       重復(fù)離心）；

7、 取 50µl 下層用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 2 倍

此方法與呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、         呋喃妥因代謝物、氯霉素試劑盒可合一處理。

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u 測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定

個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物 50µl/孔，然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。

6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：加入底物A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。

8、 測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方

法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃西林代謝物量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3， 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是： 0ppb 為 2.243；0.02ppb 為 1.816；0.06ppb 為 1.415；

0.18ppb 為 0.74；0.54ppb 為 0.313；1.62ppb 為 0.155。

2 4 程序中的要點(diǎn)。則樣本 1 的濃度范圍是 0.54ppb～1.62ppb；樣本 2

呋喃它酮代謝物 ＜0.1%

u 樣本回收率

組  織 95%±25%

雞  蛋 95%±25%

三、試劑盒組成

稱 11.4g K₂HPO₄·3H₂O 加去離子水溶解定溶至 500ml。

配液 2 1M HCl 溶液：

取 8.6ml 濃HCl 加去離子水定容至 100ml。配液 3 1M NaOH 溶液：

稱 4g NaOH 加去離子水定容至 100ml

配液 4 樣本復(fù)溶液：

將 2X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：1 稀釋。

u 樣本處理

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～

25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2-8℃。

的濃度范圍是 0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃西林代謝物實(shí)際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以 100%，即

B

肌肉組織、雞蛋樣本處理方法

3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去

離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份

百分吸光率（%）＝

×100%

B₀

1、 稱取 1±0.05g 的均質(zhì)物，分別加入 4ml 的蒸餾水，0.5ml 1M HCl 溶液和 100µl 衍生化試劑， 充分振蕩 2min；

去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B₀—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃西林代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中， 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃西林代謝物實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項(xiàng)

1、 室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～

25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

1、 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請放心使用。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

1、 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。