RIPA裂解液（強(qiáng)）說明書

RIPA Lysis Buffer

目錄號(hào)：K2333

保存條件：4℃保存。

組分說明

                            Cat. No.         K2333

                             Volume        100 ml

               本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途產(chǎn)品簡介

　　RIPA裂解液是一種傳統(tǒng)的組織以及細(xì)胞快速裂解液，主要用于從動(dòng)物組織和哺乳

動(dòng)物細(xì)胞中抽取可溶性蛋白，可用于裂解貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。按照其裂解液的強(qiáng)度

可以分為強(qiáng)、中、弱三類，具體特點(diǎn)和差異請參考附表2，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)產(chǎn)

品。RIPA裂解液（強(qiáng)）可以有效提取細(xì)胞核、細(xì)胞膜和胞漿蛋白，提取的蛋白可應(yīng)用

于蛋白定量、Western Blot、IP等檢測分析。

　　RIPA裂解液（強(qiáng)）的主要成分為50mM Tris（pH 7.4），150mM NaCl，1%Triton

X-100，1%  sodium  deoxycholate，0.1%  SDS以及sodium  orthovanadate，sodium

fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑，可有效抑制蛋白降解。

注意事項(xiàng)

1．為防止蛋白降解，所有的操作盡量在冰上進(jìn)行。

2．使用RIPA裂解液得到的蛋白樣品，可采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，以測定蛋白濃度。

   產(chǎn)品可單獨(dú)向本公司訂購，如：YJ0014  BCA蛋白定量試劑盒。本品含有高濃度的

   去垢劑，不能用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。

3．建議在使用RIPA裂解液前，向溶液中加入蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，以防止蛋

   白降解，或保持蛋白的磷酸化狀態(tài)。產(chǎn)品可單獨(dú)向本公司訂購，如：K2200                                      蛋白酶抑制劑混合物，K2383 磷酸酶抑制劑混合物。

4．若需獲得更高濃度的蛋白，應(yīng)減少哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑的使用量。

5．對于培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞，推薦先使用常規(guī)方法消化細(xì)胞，再參考懸浮細(xì)胞蛋白提

   取步驟操作。

6．對于離心獲得的細(xì)胞，若不確定細(xì)胞體積，可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量計(jì)算RIPA裂解液的使用

   量。如5×10⁶個(gè)Hela細(xì)胞約需加入500 μl RIPA裂解液，以此類推。

操作步驟

  I  細(xì)胞樣品

 · 貼壁細(xì)胞蛋白抽提

1．小心傾去貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液。

2．可選步驟：若培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì)，請先使用預(yù)冷的

   PBS漂洗細(xì)胞。

3．加入適量RIPA裂解液（使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），試劑使用量請參考

   附表1，在冰上用槍頭吹打貼壁細(xì)胞。

表 1   貼壁細(xì)胞RIPA 裂解液使用量推薦表

細(xì)胞培養(yǎng)板類型或培養(yǎng)面積                         RIPA  裂解液使用量

                     100 mm*                         500-1,000 µl

                      60 mm                          250-500 µl

                    6 孔培養(yǎng)板                          200-400 µl /孔

                   24 孔培養(yǎng)板                          100-200 µl /孔

                   96 孔培養(yǎng)板                          50-100 µl /孔

 * 對于100 mm培養(yǎng)板培養(yǎng)的107個(gè)細(xì)胞 (50 mg)可裂解獲得約3 mg總蛋白（細(xì)胞類型不同略有差異）。

4．將裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，冰上孵育20分鐘，使細(xì)胞充分裂解。

5．14,000×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進(jìn)行下一步分析。

 · 懸浮細(xì)胞蛋白提取

1．懸浮細(xì)胞2,500×g，離心5分鐘，棄去上清。

2．可選步驟：若培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì)，請使用PBS漂洗

   細(xì)胞。漂洗后的細(xì)胞懸浮液2,500×g離心5分鐘，棄去上清。

3．加入適量RIPA裂解液（使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），每5×106細(xì)胞加入約

   200-500 µl RIPA裂解液，吹打均勻。

4．冰上放置20分鐘，使細(xì)胞充分裂解。

5．14,000×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進(jìn)行下一步分析。

  II  組織樣品

1．取適當(dāng)?shù)?/font>RIPA裂解液，在使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑。

2．稱量實(shí)驗(yàn)組織的重量，按照1：10（g/ml）的比例加入RIPA裂解液后將組織剪成細(xì)

   小碎片，用電動(dòng)勻漿器勻漿處理。若需要濃縮的蛋白提取物，可適當(dāng)減少組織蛋白

   抽提試劑使用量。

3．冰上孵育20分鐘，使細(xì)胞充分裂解。

4．14,000×g 離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進(jìn)行下一步分析。

   注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中可能會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為基因組。

    相關(guān)產(chǎn)品信息

            目錄號(hào)                 產(chǎn)品名稱

            K2333              RIPA裂解液（強(qiáng)）

            K2334              RIPA裂解液（中）

            K2335              RIPA裂解液（弱）

            K2336              RIPA裂解液（強(qiáng)中弱套裝）

            K2337              SDS裂解液

            K0002/K0889       哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑/哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒

            K0004/K0891       組織蛋白抽提試劑/組織蛋白抽提試劑盒

            K0199B             Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒

            K2200              蛋白酶抑制劑混合物

            K2383              蛋白磷酸酶抑制劑混合物

            K0014              BCA蛋白定量試劑盒

            K0022              SDS-PAGE凝膠制備試劑盒

            K0023              ProteinShow-G250蛋白快速染色試劑

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