動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒（DNase I）說明書

 RNApure Tissue Kit（DNase I）

 動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒（DNase I）

 目錄號(hào)：K0560

 保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃

        其它組分：室  溫

 組分說明

                                                Cat.No.            K0560

                                                 KitSize              50

                                                DNaseI             1000U

                                           10×ReactionBuffer        1000 μl

                                                BufferRL             35ml

                                               BufferRW1             40ml

                                       BufferRW2（concentrate）         11ml

                                           RNase-FreeWater           10ml

                                            SpinColumnRM             50

                                       CollectionTube（1.5ml）          50

                                        CollectionTube（2ml）          50

 產(chǎn)品簡(jiǎn)介

      本試劑盒將高效的異硫氰酸胍裂解技術(shù)與硅基質(zhì)膜純化技術(shù)相結(jié)合，可從動(dòng)物細(xì)胞及組織中高效提取總 RNA。起始樣本一般多 30mg 組織或 1x107 細(xì)胞。本試劑盒還可回收未*純化的 RNA、體外轉(zhuǎn)錄和酶促反應(yīng)后得到的 RNA。用本試劑盒可提取純化分子量大于 200 堿基的高品質(zhì) RNA，幾乎無 DNA 殘留。如果要進(jìn)行對(duì)微量 DNA 非常敏感的 RNA 實(shí)驗(yàn)，殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase 在柱上進(jìn)行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、NothernBlot、DotBlot等下游實(shí)驗(yàn)。

 注意事項(xiàng)

 1.  預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

    1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

    2）玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

    3）配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

    4）操作人員戴一次性*罩和手套，實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。

 2.  提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。

 3.  BufferRL 在使用前請(qǐng)加入β-巰基乙醇，1mlBufferRL 加 10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 BufferRL 室溫可保存1 個(gè)月。

 4.  第-次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 BufferRW2 中加入無水乙醇。

 5.  BufferRL 如果產(chǎn)生沉淀，可于 56℃加熱使其溶解后室溫放置。

 6.  所有離心步驟均在室溫下進(jìn)行，且所有操作步驟動(dòng)作要迅速。

 自備試劑：  β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA）  

操作步驟

1.  樣品處理

    1a. 組織：將組織在液氮中磨碎。每20-30 mg組織加600  μl Buffer RL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇），組織樣本少于20 mg加350  μl Buffer RL。樣品體積不超過BufferRL體積的十分之一。

 1b 單層培養(yǎng)細(xì)胞：將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中直接裂解或處理成細(xì)胞懸液，離心得到細(xì)胞沉淀，棄上清，每6-10 cm ²培養(yǎng)面積加入600  μl Buffer RL，小于6 cm² 加入350  μl Buffer RL，反復(fù)吹打幾次，使其充分裂解。

    1c. 細(xì)胞懸液：12,000rpm6（～13,400×g）離心1分鐘棄上清，得到細(xì)胞沉淀。每5×10⁶ -1×10⁷ 細(xì)胞加入600 μl Buffer RL ，少于5×10⁶細(xì)胞加入350 μl Buffer RL，反復(fù)吹打幾次，使其充分裂解。

注意：1）盡量除盡細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)基可能抑制細(xì)胞的裂解影響RNA產(chǎn)量。

 2）盡量使細(xì)胞充分懸浮并充分裂解，否則影響RNA產(chǎn)量。

2.  樣品充分裂解后，室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物*分離。

3.  12000rpm離心2-5min，取上清進(jìn)行以下操作。

4.  向步驟3中得到的溶液中加入1倍體積（600  μl 或350  μl）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。

    注意：加入乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.  將上步所得溶液全部加入到吸附柱（SpinColumnRM）中（吸附柱已裝入收集管CollectionTube中），若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入，12,000rpm離心1分鐘，棄廢液。將吸附柱放回收集管中。

    注意：吸附柱的大載量為100µg，不要超載，否則會(huì)影響RNA的產(chǎn)量和純度。

6.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7.  配制DNaseI 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1U/μl），混勻，配制成終體積為80 μl的反應(yīng)液。

8.  向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分鐘。

9.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.  向吸附柱中加入500  μl Buffer  RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）,12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢

液，將吸附柱放回收集管中。

11.  重復(fù)步驟10。

12.  12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。

    注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR 等）。

13.  將吸附柱轉(zhuǎn)入新的RNase-Free的1.5ml 收集管中，向吸附膜中間位置加入30-50  μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12,000rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）RNase-FreeWate體積不應(yīng)小于30 μl，體積過小影響回收率。

2）如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重復(fù)步驟13。

3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟13。

細(xì)胞熒光染料標(biāo)記檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)代做