瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒操作使用

時間：2019-11-21閱讀：1987

瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒

Midi Purification Kit

產(chǎn)品信息：

試劑盒組成保存 DH101-01 DH101-02

100 次 200 次

溶膠液 DD 室溫 50ml 100ml

25ml 25ml×2

漂洗液 WB 室溫次使用前按說明加量乙醇

洗脫緩沖液 EB 室溫 15ml 15ml

吸附柱 EC 室溫 100 個 200 個

收集管（2ml）室溫 100 個 200 個

產(chǎn)品介紹：

在高離序鹽存在的情況下，DNA的片斷選擇性的吸附于離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜上，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，漂洗

液將引物、核苷酸、蛋白、酶等雜質(zhì)去除，后用低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈 DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品特點：

1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2.使用了溶膠液，不含傳統(tǒng)溶膠液的碘化納和高氯酸鹽，不抑制回收后酶切、連接克隆等下游反應。

3.溶膠液調(diào)制成為了黃顏色，便于觀察溶膠效果和監(jiān)測 pH 值變化從而達到理想結合效果，大大提高回收效率。

注意事項:

1.所有的溶液應該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應該直接使用，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清。使用前應該恢復到室溫。

2.儲存于低溫（4℃或者-20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下（15℃-25℃）進行。

3.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

4.溶膠液中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要立即用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5.回收純化的DNA的片段一般在100bp到40kb之間，過長、過短片段的回收效率降低。

6.回收DNA的量和起始DNA的量、洗脫體積、DNA的片斷大小有關。一般1-20μg， 100bp-5kb的DNA片段，回收率可高達85%-95%。

7.切膠回收時，紫外燈觀察對DNA的片段有損壞作用，應該盡可能使用能量低的長波紫外線，并且盡可能的縮短紫外線下處理的時間。

8.pH值≤7.5時，吸附膜吸附DNA的效率高。如果切下來的凝膠中含有電泳緩沖液太多，造成溶膠后溶膠液pH偏高，會導致回收率降低。溶膠后，如果溶膠液依舊保持黃色，說明pH正常；如果變成橘紅色或者淡紫色，說明pH偏高，可在膠充分溶解后加5-10μl 3M醋酸鈉（pH5.2）將pH值調(diào)到5-7（黃色）。

9.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫，DNA的片段應該保存在-20℃。DNA片段如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

自備試劑：無水乙醇操作步驟：

提示：第yi次使用前請先在漂洗液 WB 中加入量無水乙醇，加入后請及時打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

1.在長波紫外燈下，用干凈刀片將所需回收的 DNA 條帶切下，盡量切除不含 DNA 的凝膠，得到凝膠體積越小越好。

2.將切下的含有DNA條帶凝膠放入 1.5ml離心管，稱重。

3.加3倍體積溶膠液DD。（凝膠重為 100mg，則加入300μl溶膠液）

如果凝膠濃度大于 2％，應加入6倍體積溶膠液。

4.56℃水浴放置 10min（或直至膠*溶解）。每 2-3min 渦旋震蕩一次加速溶解。

5.可選,：每 100mg初的凝膠重量加入150μl的異丙醇，震蕩混勻。

6.將上一步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置 1min，12,000rpm離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液。

7.加入500μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm離心 30sec，棄掉廢液。

8.重復操作步驟 7。

9.將吸附柱EC放回空收集管中，12,000rpm 離心 2min，盡量去除漂洗液，以免漂洗液中殘留的乙醇抑制下游反應。