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        1. 上海研謹(jǐn)生物科技有限公司

          Ca++ Mg++-ATP 酶活性測(cè)定說(shuō)明書(shū)

          時(shí)間:2019-4-18閱讀:959
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          貨號(hào):YJ2275                                                  規(guī)格:50管/24樣

          Ca++ Mg++-ATP 酶活性測(cè)定說(shuō)明書(shū)

          可見(jiàn)分光光度法

          產(chǎn)品說(shuō)明

          Ca++ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成ADP和無(wú)機(jī)磷。根據(jù)Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及無(wú)機(jī)磷,通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)確定ATP 酶活性高低。

          需自備的儀器及用品

          可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

          試劑的組成和配制:

          提取液:液體50mL ×1 瓶,4℃保存。

          試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。

          試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

          試劑三:液體 5ml×1 瓶,4℃保存。

          試劑四:粉劑×3 支,-20℃保存。用時(shí)每支加1mL 蒸餾水,現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃可保存一周。

          試劑五:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

          試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時(shí)加入3mL 蒸餾水, 4℃保存。

          試劑七:粉劑×1 瓶4℃保存。用時(shí)加入25mL 蒸餾水,溶解后4℃保存一周。

          試劑八:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時(shí)加入25mL 蒸餾水,溶解后4℃保存一周。

          試劑九:液體25mL×1 瓶,室溫保存。

          試劑十:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。

          0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑十20倍稀釋?zhuān)慈?0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水

          充分混勻

          定磷劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

          注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

          樣品酶液的制備:

          1. 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

          細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30 次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

          組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約0.1g 組織,加入1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

          1. 血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

          操作步驟:

          1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm,蒸餾水調(diào)零。
          2. 酶促反應(yīng)(在EP 管中加入下列試劑)

           

          對(duì)照管

          測(cè)定管

          試劑一(μL)

          130

          90

          試劑二(μL)

          40

          40

          試劑三(μL)

          40

          40

          試劑四(μL)

          40

          40

          試劑五(μL)

           

          40

          樣本 (μL)

           

          200

          混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴10min。

          試劑六(μL)

          50

          50

          樣本 (μL)

          200

           

          混勻,8000g,常溫離心10min,取上清液

          1. 定磷(1.5mLEP 管中依次加入下列試劑)

           

          空白管

          標(biāo)準(zhǔn)管

          對(duì)照管

          測(cè)定管

          0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液(μL)

           

          100

           

           

          上清液(μL)

           

           

          100

          100

          蒸餾水(μL)

          100

           

           

           

          定磷試劑(μL)

          1000

          1000

          1000

          1000

          混勻,室溫放置30 min,在 660nm 處比色。

          注意事項(xiàng):

          1. 由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照,本試劑盒50管只能測(cè)24份Ca++ Mg++-ATP 酶。
          2. 此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷。避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。
          3. 空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

          計(jì)算

          1. 血清(漿)Ca++ Mg++-ATPase 活力的計(jì)算:

          定義:規(guī)定每小時(shí)每毫升血清(漿)中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

          Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/mL)=[ C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷V 樣÷T=7.5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

          1. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Ca++ Mg++- ATPase 活力的計(jì)算:
          1. 按蛋白濃度計(jì)算:

          定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

          ATP 酶活力(U/ mg)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷(V 樣×Cpr)÷T =7.5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr

          1. 按樣本鮮重計(jì)算:

          定義:每小時(shí)每克組織中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力位。

          Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W× V 樣÷V樣總)÷T=7.5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

          1. 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

          定義:規(guī)定每小時(shí)每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

          Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(500×V 樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

           

          C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V 總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;V 樣:加入樣本體積,0.2mL ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/6 小時(shí);Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。

           

          糖原含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

          小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3)培養(yǎng)說(shuō)明書(shū)

          EF21AJ1  孔雀石綠(0.05ppb)

           

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