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貨號(hào):YJ2275 規(guī)格:50管/24樣
Ca++ Mg++-ATP 酶活性測(cè)定說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
產(chǎn)品說(shuō)明:
Ca++ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成ADP和無(wú)機(jī)磷。根據(jù)Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及無(wú)機(jī)磷,通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)確定ATP 酶活性高低。
需自備的儀器及用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體50mL ×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:液體 5ml×1 瓶,4℃保存。
試劑四:粉劑×3 支,-20℃保存。用時(shí)每支加1mL 蒸餾水,現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃可保存一周。
試劑五:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時(shí)加入3mL 蒸餾水, 4℃保存。
試劑七:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時(shí)加入25mL 蒸餾水,溶解后4℃保存一周。
試劑八:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時(shí)加入25mL 蒸餾水,溶解后4℃保存一周。
試劑九:液體25mL×1 瓶,室溫保存。
試劑十:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑十20倍稀釋?zhuān)慈?0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水
充分混勻
定磷劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
樣品酶液的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30 次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約0.1g 組織,加入1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
操作步驟:
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
試劑一(μL) | 130 | 90 |
試劑二(μL) | 40 | 40 |
試劑三(μL) | 40 | 40 |
試劑四(μL) | 40 | 40 |
試劑五(μL) |
| 40 |
樣本 (μL) |
| 200 |
混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴10min。 | ||
試劑六(μL) | 50 | 50 |
樣本 (μL) | 200 |
|
混勻,8000g,常溫離心10min,取上清液 |
| 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液(μL) |
| 100 |
|
|
上清液(μL) |
|
| 100 | 100 |
蒸餾水(μL) | 100 |
|
|
|
定磷試劑(μL) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻,室溫放置30 min,在 660nm 處比色。
注意事項(xiàng):
計(jì)算
定義:規(guī)定每小時(shí)每毫升血清(漿)中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/mL)=[ C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷V 樣÷T=7.5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
ATP 酶活力(U/ mg)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷(V 樣×Cpr)÷T =7.5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr
定義:每小時(shí)每克組織中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W× V 樣÷V樣總)÷T=7.5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
定義:規(guī)定每小時(shí)每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(500×V 樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V 總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;V 樣:加入樣本體積,0.2mL ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/6 小時(shí);Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。
小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3)培養(yǎng)說(shuō)明書(shū)
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