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貨號(hào):YJ1347 規(guī)格:100管/96樣
線粒體復(fù)合體Ⅱ試劑盒說明書
微量法
正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同時(shí)輔基FAD還原為FADH2,后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q,是呼吸電子傳遞鏈的支路。
測定原理:
復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計(jì)算該酶活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體 100mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑二:液體 20mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑三:液體 1.5mL×1 支,-20℃保存;
試劑四:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;
試劑六:液體 2.5mL×1 瓶,4℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿 600g,4℃離心5min。
3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅱ(此步可選做)。
5、步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅱ酶活性測定。
測定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至605nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
(1)工作液的配制:臨用前把試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑4℃可保存一周;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、25μL試劑六和200μL工作液,立即混勻,記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
復(fù)合體Ⅱ活力單位的計(jì)算:
a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下:
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)
÷T=113×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.226×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.35×10 -4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L/ mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。
b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下:
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣) ÷T
=1118×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=226×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.452×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.35×10 -4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×10 4 L/ mol /cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。
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