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1. 細胞計數(shù)的意義
計數(shù)細胞是了解細胞數(shù)量變化的基本方法,細胞數(shù)量變化是細胞生理功能表現(xiàn)的重要指標,準確的細胞數(shù)量變化提供準確的功能信息,錯誤的細胞數(shù)量變化提供錯誤的功能信息。所以細胞計數(shù)準確性決定細胞生理學研究的成功與失敗。
2. 細胞計數(shù)要解決的問題
細胞計數(shù)的目的是確定細胞樣本中的細胞數(shù)量,一般是指單位體積內(nèi)的細胞數(shù)量,如1升血樣本中含有多少個紅細胞,多少個白細胞;細胞學實驗經(jīng)常需要比較細胞處理前后的數(shù)量變化。計數(shù)細胞就是確定細胞樣本處理前后每單位樣本中含有多少個細胞,即單位體積內(nèi)的細胞數(shù)。
3. 現(xiàn)行細胞計數(shù)儀器和計數(shù)方法存在的問題
現(xiàn)在計數(shù)細胞的儀器和方法不少,但計數(shù)準確度都不高,達不到細胞學研究要求的水平。原因出在細胞計數(shù)儀設計師對細胞計數(shù)的目的要求和細胞計數(shù)操作過程,認識不夠清楚,設計的儀器結構原理有問題。以細胞計數(shù)板為例,細胞計數(shù)板的結構不太合理。細胞計數(shù)板的結構是在一片玻璃板上蝕刻出一個細胞計數(shù)池,呈方形,邊長1mm,深度0.1mm,容積是0.1mm3=0.1微升=萬分之一毫升,底面用線分割成方格。計數(shù)板計數(shù)的細胞數(shù)準確度沒有問題,刻蝕的容積也沒有問題,問題出在使用方法。細胞計數(shù)的時候,計數(shù)池上面加了一個蓋玻片,細胞樣本是從計數(shù)板與蓋玻片之間的縫隙中加進去的。細胞液充滿計數(shù)池和計數(shù)池與蓋玻片之間的空隙,這個空隙中的細胞也進入計數(shù)池。因此計數(shù)的細胞體積應該是計數(shù)池的體積加上空隙體積??障扼w積是多大,不知道,計算細胞密度的時候都不計算內(nèi),被忽略掉了,所以細胞計數(shù)板計數(shù)的細胞密度不準確??p隙體積很小,但相對于只有0.1微升的計數(shù)池體積,影響是很大的,可能達到15%或更大,所以是不可以忽略掉的。計數(shù)池容積太小和加蓋玻片是細胞計數(shù)板的致命傷。
細胞計數(shù)板是細胞計數(shù)方法,優(yōu)點是簡單、方便,計數(shù)細胞真實,數(shù)量準確。缺點是計量體積不準確,計數(shù)結果不準確,另外計數(shù)的細胞無法回收使用和細胞數(shù)量少于10萬的樣本無法計數(shù)也是問題。
細胞自動計數(shù)分析儀(Cellometer )是最近推出來的細胞計數(shù)方法。Cellometer的問題比較大。Cellometer是基于圖像分析的細胞計數(shù)儀。計數(shù)原理類似與血球計數(shù)板,只是用儀器攝像代替人眼觀察細胞計數(shù)。加20ml樣本到計數(shù)儀計數(shù)板的樣品室內(nèi),使細胞平鋪為單層細胞,將計數(shù)板放入計數(shù)儀內(nèi),通過儀器攝像頭選擇一個視野,記錄視野內(nèi)的細胞。該儀器的細胞計數(shù)方法沒有記錄樣品室內(nèi)的全部細胞,只是選取樣品室內(nèi)細胞分布的一個視野進行計數(shù)。儀器設定的視野面積近似于血球計數(shù)板一個白細胞計數(shù)單位的面積,沒有考慮樣品深度,而且顯微鏡視野面積受放大倍數(shù)影響,面積和深度都不確定,體積更是問題,體積不準確,計數(shù)出來的細胞濃度不會準確。因此Cellometer細胞計數(shù)方法可信度很低。
流式細胞計數(shù)儀,以B.Dtc20-automated-cell-counter 為例,是臨床醫(yī)學應用比較多的細胞計數(shù)方法。這是一種基于庫爾特原理的細胞計數(shù)儀。庫爾特原理認為,懸浮在電解液中的顆粒隨電解液通過小孔管時,取代相同體積電解液,導致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化,產(chǎn)生電位脈沖,脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。這類細胞計數(shù)儀是根據(jù)細胞通過小孔引起電位變化計算細胞個數(shù)。儀器根據(jù)細胞體積大小設定脈沖信號上下限,在上下限之間的顆粒信號作為細胞記錄,大于上限和小于下限的顆粒信號不作為細胞記錄,與顆粒的顏色、形狀、性質(zhì)無關。這種計數(shù)方法不能區(qū)分細胞與非細胞顆粒,體積與細胞大小相同的非細胞顆粒也作為細胞記錄下來,非細胞顆粒造成假陽性細胞,大于和小于設定孔徑的細胞不作細胞計數(shù)造成假陰性。這類細胞計數(shù)儀的優(yōu)點是,自動化程度高,快速方便,樣本體積計量準確;主要問題是存在假陽性和假陰性問題,誤差比較大,計數(shù)的細胞密度準確度或真實性不高,而且檢測的細胞數(shù)量不能太少,細胞不能回收使用。該方法用于臨床檢驗(要求準確度不高)還可以,但不適合細胞學實驗。
4. 細胞計數(shù)問題的解決辦法
上面介紹的三種類型細胞計數(shù)方法,涵蓋了現(xiàn)代生物醫(yī)學領域細胞計數(shù)的基本技術和方法。細胞計數(shù)是要獲得一個準確的細胞密度。細胞密度是單位體積內(nèi)的細胞數(shù)量。計數(shù)細胞樣本的體積準確,細胞數(shù)準確,密度才會準確。三種細胞計數(shù)方法,要么計數(shù)樣本體積不準確(血球計數(shù)板,自動細胞計數(shù)儀),要么細胞計數(shù)不準確(流式細胞儀),所以細胞計數(shù)結果都不夠準確。
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