qPCR 技術是在反應體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應的進行，擴增產物不斷積累，導致熒光信號不斷積累，從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進程。
根據 PCR 定量原理公式可推導出，模板起始拷貝數的對數與閾值循環(huán)數呈線性關系，模板起始拷貝數越多，熒光信號達到閾值的循環(huán)數越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數的標準樣品繪制標準曲線，根據熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產物的數量呈對應關系，只要對熒光信號進行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數。
Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環(huán)數。相同模板進行 96 次擴增，終點處產物量不恒定，但 Ct 值卻重現(xiàn)性。

模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。

目前常用熒光標記方法

方法	優(yōu)點	缺點	應用范圍
SYBR Green I	適用性廣靈敏方便便宜	引物要求高易出現(xiàn)非特異條帶	科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動植物研究
Taqman	特異性高重復性好	價格高只適合特定目標	病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷
分子信標	高特異性熒光背景低	只適合特定目標設計困難價格高	特定基因分析，SNP分析

熒光定量 PCR 反應體系舉例
試劑	含量
2xGoTaq Master Mix	5µl
無核酸酶水	3.5µl
上游引物	0.25µl
下游引物	0.25µl
基因組 DNA	1µl（約20ng）梯度稀釋
共 10µl

儀器與耗材

在普通 PCR 儀的基礎上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道，有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學臨床檢測，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構。

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實時熒光定量PCR工作原理

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