"在 HPTLC 系統(tǒng)中，每張板都代表一個新的分析體系。每次進(jìn)行分析操作當(dāng)天，在每個板上都應(yīng)執(zhí)行 SST，以驗證其是否符合實驗條件要求。SST 通常僅適用于包含預(yù)設(shè)限值在內(nèi)的單個方法。如果 SST 失敗，則樣品檢測數(shù)據(jù)無效，無法進(jìn)行評估。"
在高效薄層色譜 (HPTLC) 中，應(yīng)用合適的系統(tǒng)適用性測試 (SST) 在每個薄層板上對分析系統(tǒng)進(jìn)行驗證非常重要，是數(shù)據(jù)有效性的前提，一般是選擇幾個具有特定分析方法的化學(xué)對照物質(zhì)作為參考。但目前常用的 SST 實驗設(shè)計具有一定的局限性，列舉《美國藥典》和《歐洲藥典》中關(guān)于 SST 的描述內(nèi)容可見下表：
目前常用 SST 方法及其局限性
美國藥典 | 歐洲藥典 | |
關(guān)于 SST 的描述 | 使用 SST “檢查系統(tǒng)對分離度、位置和條帶顏色的適用性"，選擇 “在所用色譜條件下，由兩種或多種具有相似但可分離的RF 值的化合物" 作為參考物。 | SST 基于兩種具有相似 RF 值的物質(zhì)的分離，但在規(guī)定的色譜條件下幾乎不可分離。 |
現(xiàn)有方法 局限性 | 美國藥典和歐洲藥典在定義中都描述了色譜圖特定區(qū)域內(nèi)的分離情況。 對于每種方法，都需要開發(fā)一個新的系統(tǒng)適用性測試，非常耗時。 - 如果實驗室正在應(yīng)用許多不同的 HPTLC 方法，則采購這些 SST 所需的化學(xué)參考物質(zhì)可能會增加常規(guī)分析的大量成本。 - 不同 SST 系列的開發(fā)和驗證也非常耗時。 | |
SST 新思路
HPTLC 通用混標(biāo)
針對上文列出的局限性，UHM 應(yīng)運而生，可用于在常規(guī)分析中驗證 HPTLC 結(jié)果，實現(xiàn)對 HPTLC 色譜圖的整個 RF 范圍進(jìn)行驗證。
什么是 UHM ？
UHM, the Universal HPTLC Mix，即高效薄層色譜通用混標(biāo)，由 8 種不同性質(zhì)的化合物組成，廣泛適用于各種 HPTLC 方法的 SST 測試。
HPTLC 通用混標(biāo) (UHM) 的開發(fā)
01
物質(zhì)的選擇
- 選擇的物質(zhì)最好具有安全、穩(wěn)定、無需衍生化即可檢測、易于獲得且價格低廉等特點。據(jù)此，實驗人員從數(shù)以千計的物質(zhì)列表中，選擇了 24 種化合物。
- 針對這 24 種化合物在 HPTLC 板上的色譜行為進(jìn)行研究，分別用 20 種不同展開劑進(jìn)行洗脫，涵蓋盡量廣泛的極性和選擇性，最終從中選擇了 8 種化合物：鳥苷、舒利苯酮、胸苷、撲熱息痛、鄰苯二甲酰亞胺、氫芴、噻噸酮和 2-苯并三唑四甲基丁基苯酚。
圖為 UHM 在不同展開系統(tǒng)下的色譜行為，在各條件下的選擇性均可保證至少 3 - 4 個有效化合物的條帶均勻分布在所需評估的范圍內(nèi)
02
評估響應(yīng)特性
- 相對濕度對每種物質(zhì)的選擇性有不同的影響。當(dāng)板的活性偏離預(yù)期的相對濕度 0 - 5%、33%、75% 或 100% 時，UHM 的響應(yīng)特性可以清楚地檢測出這些偏離。
- 對甲苯-乙酸乙酯 90:10 (V/V) 的展開劑組成施加每種組分溶劑 ±10% 的變化，用 UHM 獲得的 HPTLC 指紋圖譜有顯著反應(yīng)。
- 針對相同的展開劑進(jìn)行不同飽和參數(shù)設(shè)置的考察（不飽和、部分飽和和充分飽和)。結(jié)果表明，部分飽和 RF 值相對增加，而*飽和 RF 值相對降低，UHM 可以檢測飽和操作的一般影響。
03
評估 UHM 性能
- 分別在實驗室內(nèi)和實驗室間進(jìn)行檢測，使用 3 種展開劑并得出 ΔRF，評估 UHM 性能。
- 在實驗室內(nèi)試驗中，ΔRF 為 0.029; 實驗室間試驗為 0.040。
04
評估不同類型的硅膠薄層板
- 在色譜系統(tǒng)中薄層板的材料是一個關(guān)鍵參數(shù)。由于硅膠的規(guī)格不同，例如不同的粘合劑或熒光指示劑的存在，不同的薄層板可能會有不同的選擇性。
- 使用 UHM 評估了 6 種不同類型的涂敷型硅膠薄層板，使用相同的展開劑，乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水 100:11:11:26 (V/V)。
UHM 與現(xiàn)行 SST 比較
使用 UHM 和現(xiàn)行的 SST 進(jìn)行精油標(biāo)準(zhǔn)鑒別。
- 在原有方法中乙酸異丁香酚 [1a] 和異丁香酚 [1b] 被定義為 SST。作為特定標(biāo)記物，使用的是芳樟醇和乙酸芳樟酯，或冰片和乙酸冰片酯。在這個例子中，還測試了 3 種精油：薄荷油、薰衣草油和肉豆蔻油。
- 針對 UHM 和當(dāng)前 SST 的每個成分，計算平均 RF 值及其預(yù)測區(qū)間。下圖數(shù)據(jù)表明，UHM 成分的預(yù)測區(qū)間與原始 SST 的預(yù)測區(qū)間在同一范圍內(nèi)。
UHM 成分的預(yù)測區(qū)間與原始 SST 的預(yù)測區(qū)間在同一范圍內(nèi)
數(shù)據(jù)來源: CAMAG 與 Anchrom 印度合作實驗室
總結(jié)
- HPTLC 通用混標(biāo) (UHM) 是當(dāng)前 SST 的一個很好的替代方法。
- 8 種不同極性、不同化學(xué)類別組分的混合物價格低廉、穩(wěn)定，對驗證色譜系統(tǒng)的變化具有良好的響應(yīng)性。
- 與當(dāng)前的 SST 相比，UHM 的成分顯示出與已建立的 SST 的物質(zhì)和特定標(biāo)記物具有相似的預(yù)測區(qū)間。
- UHM 可以檢測展開劑梯度的變化或飽和效應(yīng)，而許多已建立的 SST 通常只能描述有限的 RF 范圍。
會議內(nèi)容重溫
由此可見，高效薄層色譜越來越受實驗人員的關(guān)注，原因不單在其快速、直觀、自由衍生的技術(shù)優(yōu)勢，而且適用于復(fù)雜成分樣品的分離及檢測。從以上案例中，通過通用混標(biāo)的應(yīng)用，簡化 SST 方法開發(fā)周期，有效保證 HPTLC 在常規(guī)分析檢測中的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性、有效性和可靠性。
CAMAG HPTLC PRO 全自動色譜系統(tǒng)實現(xiàn)連續(xù)多板之 “點樣 – 展開 – 衍生 – 檢測 – 分析 – 報告" 操作流程，是新一代的高效薄層色譜的技術(shù)。
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