 |
上海源葉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： S30260異硫氰酸胍,30259鹽酸胍,嗜熱菌蛋白酶 |
聯(lián)系電話
15921386130
公司信息
- 聯(lián)系人：
- 何小姐
- 電話：
- 86-021-61559134
- 手機(jī)：
- 15921386130
- 傳真：
- 86-021-55068248
- 地址：
- 上海市松江區(qū)長塔路465號6幢
- 郵編：
- 200433
- 網(wǎng)址：
- www.shyuanye.com
MTT比色法檢測IL-2的生物活性
2012-3-10 閱讀(1801)
【基本原理】
IL-2的生物活性檢測法是檢測IL-2對靶細(xì)胞（或反應(yīng)細(xì)胞）的促增殖作用的能力。IL-2反應(yīng)細(xì)胞增殖程度可以增殖細(xì)胞中DNA合成或酶活性為指示系統(tǒng)，通過測定3H-TdRDNA摻入量或MTT比色法OD值，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照，間接測定IL-2的生物活性單位。以下三類細(xì)胞可作為IL-2的檢測細(xì)胞：①IL-2依賴細(xì)胞株，如CTLL，CTLL-2，尤以后者zui常用；②有絲分裂原活化的T淋巴母細(xì)胞；③小鼠胸腺細(xì)胞。下面主要介紹以CTLL-2細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞檢測IL-2的生物學(xué)活性，又包括MTT比色法與3H-TdR摻入量兩種基本方法，其原理參見IL-1的生物活性檢測部分。
【材料和試劑】
（1） CTLL-2細(xì)胞：作為反應(yīng)細(xì)胞或靶細(xì)胞。
（2） 待測樣品：從1:2開始作倍比稀釋，至少6個稀釋度。
（3） IL-2標(biāo)準(zhǔn)品：同上作倍比稀釋，至少6個不同稀釋度
（4） 10% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液
（5） MTT：用PBS配成濃度為5mg/ml的MTT溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌及雜質(zhì)，4℃避光保存。
（6） 酸化異丙醇：100ml異丙醇中加入0.4ml 36%HCl即可成為0.04mol/L HCl的異丙醇。
（7） 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，刻度吸管、毛細(xì)吸管，加樣器（頭），刻度離心管，離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱，酶標(biāo)測定儀，570nm和630nm濾光片。
【操作步驟】
（1） 用10% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液洗滌CTLL-2細(xì)胞2次，1000r/min離心5min，以去除原生長培養(yǎng)液（含有IL-2）；
（2） 用10%FCF-RPMI-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/ml；
（3） 將不同倍比稀釋度的IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品分別加入96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔，各設(shè)3復(fù)孔，并同時設(shè)培養(yǎng)液對照；
（4） 各孔內(nèi)均加入CTLL-2細(xì)胞懸液，100μl/孔；
（5） 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（18-24h均可）；
（6） 細(xì)胞培養(yǎng)至18-24h時，各孔加入MTT溶液，10μl /孔繼續(xù)培養(yǎng)4h；
（7） 取出培養(yǎng)板，先從各孔中輕輕吸出100μl上清液棄去。再加入酶化異丙醇或DMSO，100μl/孔，置室溫10-20min，吹打震蕩，充分混勻，使MTT-甲肷產(chǎn)物充分溶解；
（8） 用酶標(biāo)儀的檢測波長570nm，參考波長630nm，分別測定各孔OD值，測定應(yīng)在加入酸化異丙醇后1h內(nèi)完成。
【結(jié)果分析】
（1） 每孔OD值應(yīng)取3復(fù)孔的平均值，zui終各孔OD值應(yīng)為OD570nm-OD630nm，再減去培養(yǎng)液對照孔OD值；
（2） 按概率單位分析法計(jì)算IL-2活性單位（參見IL-1的生物活性檢測法部分）：樣品IL-2活性單位采用下列公式計(jì)算：
樣品IL-2活性單位（U/ml） = 達(dá)標(biāo)準(zhǔn)品zui大OD值50%的樣品稀釋度 × 標(biāo)準(zhǔn)品IL-2活性單位
（U/ml）
達(dá)zui大OD值50%對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度
【注意事項(xiàng)】
（1） CTLL-2細(xì)胞存活率應(yīng)＞95%（細(xì)胞折光性好，形態(tài)飽滿），洗滌時操作不要太猛烈，因CTLL-2細(xì)胞膜極脆，容易破碎而影響檢測結(jié)果。
（2） CTLL-2細(xì)胞要充分洗滌，因原生長培養(yǎng)液中含有IL-2。
（3） CTLL-2細(xì)胞對鼠IL-4亦有增殖反應(yīng)，若樣品中含有鼠IL-4，將影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，此時可用抗鼠IL-4 McAb處理待測樣品后再進(jìn)行檢測。但CTLL-2細(xì)胞對人IL-4無增殖反應(yīng)。
（4） CTLL-2的*終濃度宜為1×104/孔，且應(yīng)均勻分布。
（5） CTLL-2細(xì)胞凍存后復(fù)蘇較為困難，而長期培養(yǎng)又易產(chǎn)生變異而干擾IL-2活性測定，應(yīng)加以注意。
（6） IL-2標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品從1:2開始至少6個倍比稀釋度，加樣時應(yīng)從低濃度到高濃度順序加入，且不可共用加樣器頭。
（7） 加入MTT的*時間應(yīng)為培養(yǎng)液對照（無IL-2）孔細(xì)胞全部死亡時，一般時間是細(xì)胞培養(yǎng)至18-24h時。
（8） 加入酶化異丙醇后，應(yīng)在1h內(nèi)進(jìn)行OD測定。如果1h內(nèi)無法測定，可將未加酸化異丙醇的96孔培養(yǎng)板暫時放入4℃冰箱保存。測定前，取出置室溫下數(shù)分鐘，再加入酶化異丙醇進(jìn)行OD值測定。
（9） 因RPMI-1640培養(yǎng)液中含有的酚紅可干擾OD值測定，而加入酶化后的異丙醇，可使培養(yǎng)液中的酚紅在酸性條件下由紅色變成黃色，從而可排除紅色對OD值測定的干擾；此外，設(shè)立培養(yǎng)液對照，可進(jìn)一步排除培養(yǎng)液對OD值測定的影響。
（10） IL-2活性單位計(jì)算方法有多種，除在IL-1活性單位計(jì)算法中所述的方法外，還可通過正態(tài)概率紙法、概率單位法計(jì)算IL-2活性單位，亦可對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，得出IL-2的活性單位。有關(guān)計(jì)算方法可參閱醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)的有關(guān)內(nèi)容。
