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上海源葉生物科技有限公司
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瘋牛病發(fā)光免疫測(cè)定方法
2011-7-9 閱讀(435)
Prionics-CheckLIA（1uminescence immunoassay）是Prionics AG公司在Prionics-CheckWestern的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種新的瘋牛病診斷方法，即發(fā)光免疫試驗(yàn)。該方法是*二代BSE診斷技術(shù)中的zui快速的檢測(cè)方法，也是*個(gè)*適合于自動(dòng)化的方法，1999年通過(guò)歐盟認(rèn)證。Prionics~-CheckLIA方法可以讓實(shí)驗(yàn)室在短期內(nèi)以少量人員的投入而完成高通量的工作，即特別適用于每天檢測(cè)數(shù)百個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)室。另外，自溶的腦組織也可以用本方法來(lái)檢測(cè)，并且*的自動(dòng)化可以減少操作中的失誤和感染BSE的風(fēng)險(xiǎn)。
本方法的原理是將PK酶消化處理過(guò)的腦勻漿與酶標(biāo)PrP單抗孵育，反應(yīng)結(jié)合物轉(zhuǎn)移到包被有另一種PrP單抗的捕獲板內(nèi)，然后加入發(fā)光底物并讀數(shù)判定結(jié)果。整個(gè)反應(yīng)時(shí)間約需4．5h，特異性和敏感性均為100％。
瘋牛病發(fā)光免疫測(cè)定方法的主要步驟如下。
（1）采樣 將牛頭從牛體上取下來(lái)以后，用小剪刀盡量往里剪開(kāi)枕骨大孔延髓部的腦膜，然后用一個(gè)手指（帶兩層手套）把延髓部腦組織與頭部相連的神經(jīng)和血管弄斷。一切準(zhǔn)備好后將采樣勺從枕骨大孔處緊貼顱壁（避免損傷腦組織）伸入顱內(nèi)，大約伸入10cm深左右停止，緊貼顱壁轉(zhuǎn)動(dòng)采樣勺，轉(zhuǎn)一圈后將采樣勺轉(zhuǎn)到與地面平行時(shí)用力往下或往上撬，同時(shí)往外摳，延髓部腦組織便會(huì)掉出顱腔。當(dāng)然，也可以采用與免疫組織化學(xué)方法相同的采樣方式，不過(guò)檢測(cè)部位為腦閂部。
（2）樣品制備 稱取0．5g腦閂組織放入勻漿管，加入10倍于（即5mi）該組織的勻漿工作液，用超聲波或其他勻漿儀器制備成腦組織懸液。之后取出lml腦勻漿液轉(zhuǎn)移到檢測(cè)板（深孔板）。
（3）PK酶消化 從檢測(cè)板每孔中各取出100／~L腦勻漿液加入到白色的消化板中，然后分別在每孔中加入50rtlPK酶消化液，混勻，用密封膜密封，47~C孵育60min。消化完后，每孔中加入10t~L消化阻止液，并混勻。
（4）孵育 在預(yù)孵板（藍(lán)色）的前兩道加入30~tL配好的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品（強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性），然后在其他孔中每孔加入15~tL檢測(cè)緩沖液，再加入15ltl消化過(guò)的樣品，混勻。在每孔中加入10,aL預(yù)孵緩沖液，室溫下孵育2min。之后，在每孔中加入200uL稀釋好的檢測(cè)抗體，用密封膜密封，室溫下孵育60rain，并以500r／min不斷搖動(dòng)。
（5）捕獲、從預(yù)孵板中每孔取出200rtl樣品加入到捕獲板（黑色），用密封膜密封，室溫下孵育90min，并·以500r／rain不斷搖動(dòng)。
（6）檢測(cè) 用洗板緩沖液洗板，洗完后在每孔中加入100aL發(fā)光底物工作液，孵育5min，然后用MPL2讀板。
