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上海源葉生物科技有限公司
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裂谷熱診斷技術(shù)--ELISA方法
2011-6-15 閱讀(467)
直到2000年，裂谷熱只限定在非洲流行，但是zui近在阿拉伯半島致死性的暴發(fā)，表明需要快速診斷、有效地處理和預(yù)防這一疾病。
該病由于沒(méi)有特征性的臨床癥狀，因此個(gè)別病例的診斷較為困難，但是該病具有以下流行特征：眾多動(dòng)物流產(chǎn)，新生畜大批死亡，乃至人群發(fā)病。RVFV通常流行于非洲國(guó)家，流行常伴隨著特大降雨的周期循環(huán)，較少發(fā)生在半干旱地區(qū)（30—35年的周期），或者較頻繁（3～10年的周期）發(fā)生在較大雨量的草原地區(qū)。
經(jīng)典的檢測(cè)裂谷熱病毒抗體的參考方法是建立在多種形式的病毒中和試驗(yàn)（VN）和血凝抑制試驗(yàn)基礎(chǔ)上的，包括微量中和試驗(yàn)，蝕斑減少中和試驗(yàn)（PRN），小白鼠中和試驗(yàn)等，主要用來(lái)檢測(cè)不同動(dòng)物血清中的病毒特異性抗體，因只能用活病毒進(jìn)行試驗(yàn)，不適合疫區(qū)外使用。盡管它們具有較高的靈敏度和特異性，但是價(jià)格昂貴且耗時(shí)，那些方法的一個(gè)很大的不利之處是對(duì)試驗(yàn)人員具有健康風(fēng)險(xiǎn)，并且限制了它們?cè)诜且邊^(qū)國(guó)家的使用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、血凝抑制（H1）、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）、免疫熒光試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等，均可用于檢測(cè)病毒，但這些試驗(yàn)的結(jié)果與白蛉熱病毒屬的其他血清型有交叉性，這些試驗(yàn)可用滅活抗原進(jìn)行，可用于無(wú)裂谷熱的國(guó)家。
ELISA具有較高的可靠性和靈敏度，可利用幾種抗原檢測(cè)RVFV特異性抗體，OIE參考實(shí)驗(yàn)室建立了間接ELISA，以滅活的細(xì)胞培養(yǎng)物作為抗原，使用G蛋白—辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，該試驗(yàn)較為靈敏，可于數(shù)小時(shí)檢測(cè)出RVFV抗體；用于ELISA檢測(cè)的抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清和操作程序均可以從參考實(shí)驗(yàn)室獲得。
OIE診斷手冊(cè)上的試驗(yàn)程序如下（除非其他說(shuō)明，使用的體積均為50ul／孔，所有的稀釋液用3g／100ml脫脂奶緩沖液，并且所有的洗滌進(jìn)行3次）。
①以預(yù)先確定的濃度分別用陽(yáng)性抗原和陰性抗原包被半塊板，每孔 50ul。4℃孵育過(guò)夜。洗板。
②每孔加入100~L封閉液，37℃孵育1h。洗板。
③將待檢血清和對(duì)照血清以預(yù)先確定的濃度分別加入到陽(yáng)性和陰性抗原孔中，每份兩個(gè)重復(fù)。37℃孵育1h。洗板。
④加人工作濃度的G蛋白—辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物。37℃孵育1h。洗板。
⑤加入提供的四甲聯(lián)苯胺底物，然后將板室溫（22℃）避光保存20min（顯色時(shí)間）。
⑥加入終止液（2mol／L硫酸），然后在450nm／650nm的光密度下讀板。
Paweska等建立了間接ELISA、IgG夾心ELISA和IgM捕獲ELISA檢測(cè)裂谷熱抗體，以適應(yīng)當(dāng)前日益增長(zhǎng)的與臨床診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)因子研究相關(guān)的診斷靈敏性和特異性的可靠評(píng)估。與病毒中和試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)相比，IgG夾心ELISA在檢測(cè)裂谷熱病毒早期感染或免疫zui早的免疫球蛋白反應(yīng)時(shí)更加靈敏。從田間取得的數(shù)據(jù)表明，它的靈敏性和特異性在不同反芻動(dòng)物中分別固定在99．5％～100％和99．1％～99．9％之間。IgG捕獲ELISA的特異度在不同動(dòng)物種類中從97．4％一99．4％之間變化；它的靈敏度在綿羊感染后的5—42天是100％。
當(dāng)然，這一疾病的診斷應(yīng)當(dāng)包括多種程序，如病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的分離，抗原的ELISA試驗(yàn)，確實(shí)的PCR方法，或者通過(guò)免疫吸附試驗(yàn)或者免疫熒光試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)病毒特異性IgG和IgM，同時(shí)這些診斷技術(shù)還應(yīng)當(dāng)與臨床癥狀、病理變化、流行病學(xué)調(diào)查等相結(jié)合。
