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利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)鑒定出寄生蟲必需基因
2016-9-5 閱讀(276)
在一項新的研究中，來自美國懷特海德研究所的研究人員在頂復(fù)門（Apicomplexa）---導(dǎo)致瘧疾、巴貝西蟲病、隱孢子蟲病和弓形蟲病的單細(xì)胞寄生蟲門---中進(jìn)行全基因組篩選。這一篩選有助認(rèn)識大量的未被研究過的寄生蟲基因組，并且揭示為所有頂復(fù)門寄生蟲所共有的一種蛋白。相關(guān)研究結(jié)果于2016年9月1日在線發(fā)表在Cell期刊上，論文標(biāo)題為“A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes”。
論文通信作者、懷特海德研究所研究員Sebastian Lourido說，“從沒有一種真正好的方法來研究任何一種頂復(fù)門寄生蟲中所有基因的功能。我們引入一種方法來評估整個基因組的功能。這種技術(shù)能夠被用來研究各種各樣的課題，如營養(yǎng)獲取、對免疫壓力作出的反應(yīng)、上位性（epistasis）和遺傳相互作用等等。這是在這些寄生蟲中開展研究成為可能所取得的重要一步。”
美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）估計在美國有6000萬多人感染上剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）。通過攝入來自被感染的貓糞便的弓形蟲卵子或者吃含有弓形蟲包囊的未煮熟的肉，它的傳播就能夠發(fā)生。在感染后，一些健康的人經(jīng)歷一個月或以上的流感狀癥狀，但是這種疾病也能夠?qū)е旅庖呤軗p的病人---包括接受移植的病人、HIV/AIDS病人、癌癥病人、老年人和年幼小孩---產(chǎn)生癲癇和潛在致命的腦炎。如果媽媽在懷孕期間被感染的話，她能夠?qū)⑦@種寄生蟲傳播給她的胎兒，這能夠?qū)е?/span>流產(chǎn)、死產(chǎn)、她的小孩大腦或眼睛損傷或者聽力喪失。
盡管弓形蟲病是一種嚴(yán)重性疾病，但是根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計，另一種頂復(fù)門寄生蟲，即導(dǎo)致瘧疾的惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum），2015年殺死了40多萬人。鑒于剛地弓形蟲與惡性瘧原蟲的親緣關(guān)系比較接近，剛地弓形蟲能夠作為研究它的致命性更強的表親（即惡性瘧原蟲）的模式生物。然而，對剛地弓形蟲的研究因科學(xué)們不能夠快速地和地敲降基因（或者說抑制基因）而一直受到阻礙。作為一種評估很多有機體中基因功能的有效工具，RNA干擾（RNAi）很大程度上不能夠在頂復(fù)門中發(fā)揮作用，與此同時，隨機突變的結(jié)果很難理解，這是因為發(fā)生突變的基因很難鑒定出。遺傳雜交也很難執(zhí)行，這是因為這種寄生蟲的有性繁殖階段僅在貓體內(nèi)發(fā)生。
再者，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)改變剛地弓形蟲的基因組也因Cas9酶的毒性而受到限制。為了克服這個障礙，Lourido團(tuán)隊構(gòu)建出“誘餌”單向?qū)NA（gRNA）從而有效地降低Cas9在基因組上的過強活性。利用這種“削弱的”CRISPR/Cas9系統(tǒng)，他們能夠破壞剛地弓形蟲的8158個基因，并研究它們每個的功能。這種方法鑒定出大約200個基因存在于所有的頂復(fù)門寄生蟲中，并且這些基因在這些寄生蟲感染人類細(xì)胞期間促進(jìn)它們保持適應(yīng)性中起著重要的作用。
在這些基因中，有一個基因編碼一種被稱作緊密連接蛋白樣頂復(fù)門微線蛋白（claudin-like apicomplexan microneme protein, CLAMP）的蛋白，它在這種寄生蟲侵入宿主細(xì)胞中發(fā)揮強大的影響。為了進(jìn)一步分析這種蛋白的作用，和證實它是另一種頂復(fù)門寄生蟲所必需的，Lourido團(tuán)隊與來自美國麻省理工學(xué)院的Jacquin Niles團(tuán)隊合作在惡性瘧原蟲對這種蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制。在沒有功能性CLAMP的存在下，這些瘧疾寄生蟲不能夠在紅細(xì)胞中生長。
盡管這種全基因組CRISPR/Cas9系統(tǒng)在剛地弓形蟲中很好地工作，但是一種等價的策略仍然在惡性瘧原蟲是不存在的。
論文共同*作者、Lourido實驗室博士后研究員Diego Huet說，“瘧原蟲真地很難以相同的方式進(jìn)行操縱。這是因為它的基因組富含A和T，所以很難在你想要的地方進(jìn)行切割。瘧原蟲也缺乏DNA修復(fù)的非同源末端連接途徑，因而當(dāng)利用CRISPR/Cas9進(jìn)行切割時，需要一種修復(fù)模板。這些問題代表著在這種寄生蟲中開展類似的全基因組測試時所面臨的技術(shù)障礙，使得弓形蟲成為一種瘧原蟲的一種更加重要的模式生物。我們能夠研究的就這么多了。”
論文共同*作者、Lourido實驗室研究助理Saima Sidik對此表示贊同，并且補充道，“如今，我們能夠開始改變這些寄生蟲所在的環(huán)境，并且觀察它們?nèi)绾巫鞒龇磻?yīng)。我們能夠通過加入藥物、加入免疫壓力，或者嘗試使用這些寄生蟲侵入的不同細(xì)胞類型，改變環(huán)境。我們能夠在一周內(nèi)敲降整個基因組，然而，在之前，我們一個月內(nèi)可能僅僅敲降一個基因。利用CRISPR篩選，這些可能性是*的。
