YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 IV 活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途
YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 IV（細(xì)胞色素 C－氧化還原酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過
細(xì)胞色素 C 氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中還原性細(xì)胞色素 C 氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性
的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種線粒體（動
物、人體、酵母等）呼吸鏈復(fù)合物 IV 的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡捷，性能
穩(wěn)定。
技術(shù)背景
線粒體呼吸鏈復(fù)合物 IV （Mitochondria Complex IV），又稱為細(xì)胞色素 C 氧化還原酶（cytochrome c
oxidoreductase）或細(xì)胞色素 C 氧化酶（Cytochrome c oxidase），存在于真核生物的細(xì)胞線粒體上，主要通
過氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量。呼吸鏈復(fù)合物 IV 是由 13 種不同的亞體構(gòu)成的復(fù)合物，其中含有 2 個血紅
素（heme）基團(tuán)（a 和 a3）和 2 個銅原子，作為輔基（prosthetic groups）。呼吸鏈復(fù)合物 IV 的遺傳變異導(dǎo)
致氧化磷酸化類疾病，包括阿茨罕默綜合癥和腫瘤等?；诘孜镞€原型細(xì)胞色素 C（reduced cytochrome c），
受到呼吸鏈復(fù)合物 IV 的催化，轉(zhuǎn)化為氧化型細(xì)胞色素 C（oxidized cytochrome c），在分光光度儀下，出現(xiàn)
吸光值的變化（550nm 波長），由此定量測定呼吸鏈復(fù)合物 IV 的活性。呼吸鏈復(fù)合物 IV 反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI 緩沖液（Reagent A）
YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）
YIJI 稀釋液（Reagent C）
YIJI 穩(wěn)定液（Reagent D）
產(chǎn)品說明書
毫升
毫升
毫升
微升
1份
保存方式
YIJI 緩沖液（Reagent A）和 YIJI 稀釋液（Reagent C）保存在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃
冰箱里；YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證 6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
實驗步驟
1

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）置入冰槽里融化，然后移出
xx 微升到新的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 穩(wěn)定液（Reagent D），輕柔混勻后，室溫下避光靜
置 15 分鐘（可見顏色變化），置于冰槽里，標(biāo)記為 YIJI 反應(yīng)工作液（注意：見注意事項 5），放在暗
室里。然后進(jìn)行下列操作。
一、 測讀準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好含有復(fù)合物 IV 的樣品，置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀：溫度 25℃，波長 550nm，間隔 10 秒，測讀 7 次（共 60 秒），并置零或設(shè)置 0 秒
和 60 秒各測讀 1 次
二、 背景對照測定
1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的 1 毫升比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI 稀釋液（Reagent C）
3． 上下傾倒數(shù)次，混勻
4． 室溫下孵育 2 分鐘
5． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零
6． （選擇步驟）取出比色皿
7． 加入 xx 微升含有 YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）和 YIJI 穩(wěn)定液（Reagent D）的 YIJI 反
應(yīng)工作液
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（0 秒讀數(shù)－60 秒讀數(shù)），正常讀數(shù)差值為 0.001 至 0.005
三、 樣品測定
1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升待測樣品（注意：建議總量 2 微克線粒體蛋白）
3． 上下傾倒數(shù)次，混勻
4． 室溫下孵育 2 分鐘
5． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零
6． （選擇步驟）取出比色皿
7． 加入 xx 微升含有 YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）和 YIJI 穩(wěn)定液（Reagent D）的 YIJI 反
應(yīng)工作液
8． 即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0 秒讀數(shù)－60 秒讀數(shù)），通常活性讀數(shù)差值為正數(shù)
四、 計算樣品活性
【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X xx（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)】÷【xx（樣品容量；毫升）X xx（毫
摩爾吸光系數(shù) X xx（反應(yīng)時間，分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾細(xì)胞色素 C/分鐘
2

注意事項
1． 本產(chǎn)品為 20 次操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 線粒體樣品中忌用 DTT 和巰基乙醇等處理
4． 線粒體樣品檢測前，須溶解；建議凍存融解（－70℃至 37℃）循環(huán) 3 次或使用 YIJI 線粒體溶解
試劑盒－GMS10018
5． 每增加 1 個樣品，增加 YIJI 反應(yīng)工作液為：YIJI 反應(yīng)液（Reagent B） 微升＋YIJIxx
穩(wěn)定液（Reagent D）1.5 微升，以此類推。配制反應(yīng)工作液時，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實際工作液容量
6． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1 次
7． 分光光度計波長嚴(yán)格設(shè)置在 550nm，誤差 10nm 將不產(chǎn)生信號
8． 加樣后 3 秒內(nèi)進(jìn)行比色測定
9． 比色測定后，比色皿須清洗*
10．背景空對照 0 秒讀數(shù)通常 0.2 至 0.8 為理想狀態(tài)
11．背景空對照的正常讀數(shù)差值（0 秒－60 秒）通常為 0.001 至 0.005（正負(fù)即可）
12．樣品 0 秒讀數(shù)通常和背景空對照 0 秒讀數(shù)一致
13．樣本測定 60 秒讀數(shù)低于 0 秒讀數(shù)表明具有酶活性
14．線粒體呼吸鏈復(fù)合物 IV 酶活性單位濃度定義：在 25℃室溫下，pH 7.0 的情況下，每單位酶在單位時
間內(nèi)（每分鐘）氧化 1 微摩爾的細(xì)胞色素 C
15．建議待測樣本為線粒體裂解懸液，則蛋白濃度為 2 微克/100 微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可
以增加或降低樣本量（本公司提供 YIJI 線粒體溶解試劑盒 GMS10018 為后續(xù)的線粒體蛋白濃度
測定的預(yù)處理試劑盒和 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 GMS30030.1）
16．如果使用細(xì)胞或組織裂解懸液，則蛋白濃度為 50 微克/100 微升
17．本公司提供系列線粒體研究產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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