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恒遠(yuǎn)告訴大家：關(guān)于WB實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)問(wèn)題以及解決方案（3）
閱讀：2268 發(fā)布時(shí)間：2012-9-14
上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司是一家生物技術(shù)企業(yè)，主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷(xiāo)售。并代理銷(xiāo)售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國(guó)外，致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù)，滿(mǎn)足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實(shí)驗(yàn)需求。
21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？
答：200kd的蛋白不好做，分離膠用7％，積層膠 3.5％。
22、如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
23、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。
24、我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?/span>105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。
25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的，是嗎？
解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用ＢＳＡ代替?yīng)該好一點(diǎn)．
26、問(wèn)一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？
答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開(kāi)始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。
27、做組織樣品的western的時(shí)候，怎樣處理樣品？
答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28、問(wèn)大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。
29、有什么方法可以提高上樣量？
答：a）可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來(lái)稀釋變性
30、蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？
答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超載。
答：200kd的蛋白不好做，分離膠用7％，積層膠 3.5％。
22、如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
23、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。
24、我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?/span>105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。
25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的，是嗎？
解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用ＢＳＡ代替?yīng)該好一點(diǎn)．
26、問(wèn)一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？
答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開(kāi)始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。
27、做組織樣品的western的時(shí)候，怎樣處理樣品？
答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28、問(wèn)大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。
29、有什么方法可以提高上樣量？
答：a）可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來(lái)稀釋變性
30、蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？
答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超載。
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