理論基礎(chǔ)

聚合酶鏈式反應作為一種革命性的方法在生物學研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括real-time PCR在內(nèi)的多項應用技術(shù)。自誕生后real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展，從簡單的增擴到整個PCR過程，real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對識別等位基因的能力。

不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個循環(huán)增擴曲線的增長。事實并非如此，早期的軟件不能在運行期間提供可視化的增擴曲線。主要是因為SDS軟件采用整個平臺終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作，而不是分析每個單獨的反應循環(huán)。對某些設(shè)備來說，必須向分析軟件提供實時的終的數(shù)據(jù)，有些設(shè)備則不需要。前一種設(shè)備允許軟件實時跟蹤每個加樣口的增擴曲線，同時顯示在電腦屏幕上。Real-time PCR其實是一種real-time設(shè)備。

RNA定量分析依靠逆轉(zhuǎn)錄酶制作cDNA（complementary DNA）。常見的逆轉(zhuǎn)錄酶有2種，AMV和MMLV。AMV是一種鳥類myeloblastosis病毒的二聚體蛋白質(zhì)，MMLV來自于鼠科leukemia病毒的monomeric蛋白。2種酶都有RNase把RNA變性為RNA-DNA雜交體的活性，比較而言AMV有更高的RNase H活性。RNase H活性和依賴于RNA的DNA聚合酶活性能被mutagenesis區(qū)分開來。更重要的是每個AMV能把較多的分子聚攏在一起，推動增擴反應的進行。原生的AMV有高于MMLV的適用溫度，42?C對37?C。修改后的變種可以有更高的溫度極限，分別是AMV58?C，MMLV55?C。

按照以上的描述，大家可能認為改造后的AMV是適宜從RNA制作cDNA的酶。然而，在實際使用中經(jīng)改造的MMLV工作的較好。其中的原因目前仍不明，猜測高溫破壞了2種酶的聚合酶活性，但殘留的DNA綁定活性對Taq polymerase形成物理障礙。二聚體構(gòu)象和較高的溫度極限也許使得AMV表現(xiàn)不佳。出于這個原因應在實驗中盡可能少的使用逆轉(zhuǎn)錄酶。需要強調(diào)的是即使沒有引物cDNA仍然能被逆轉(zhuǎn)錄反應制造出來，RNA模板的二級結(jié)構(gòu)可能自我引發(fā)反應。有3種方法可以準備逆轉(zhuǎn)錄反應：oligo-dT，random primers or assay-specific primers。其中oligo-dT的使用較廣泛，它使用mRNAs作為模板。但是不是所有mRNA都有poly-A尾，大的問題是oligo-dT把增擴區(qū)域限制在了mRNA poly-A 尾的附近。當轉(zhuǎn)錄較長的片段時（<500bp）反應開始于3’ UTR。這樣的結(jié)果有高的忠實性，也意味著增擴出的序列可能不會跨過一個外顯子連接。對于有些實驗，3’ UTR富含不利于PCR實驗的A/T堿基。因此使用自由引物制造轉(zhuǎn)錄序列放棄3’ UTR，但自由引物也同時會制造核糖體和transfer RNAs的cDNA，出現(xiàn)大量且復雜的cDNA。第三種方法是使用針對每個實驗的引物（assay-specific primers），理論上講這種引物滿足轉(zhuǎn)錄目標序列的要求，得到相應的cDNA產(chǎn)物。

Real-time PCR反應增擴子的大長度大約在250 bases，從前面的討論可知assay-specific primers是大多數(shù)實驗較佳的選擇。但是assay-specific primers有2個明顯的缺點，每次PCR反應使用較多的RNA樣本，不能用于一臺儀器上同時處理幾種樣本的反應。注意根據(jù)實驗需要合理的選擇引物，安排實驗計劃。

現(xiàn)代PCR反應的核心是耐熱DNA聚合酶，常用的是Thermus aquaticus也稱Taq。野生型Taq是依賴DNA從5->3合成的，具有3->5校對功能的聚合酶，它也有5’-nuclease的活性。Real-time PCR常用變異后移除校對功能的品種。市場上有2種版本的Taq，修改后的Taq和熱啟動（hot start）Taq。

現(xiàn)今市場上的real-time PCR設(shè)備均使用熒光劑作為信號源，熒光的強度隨著增擴產(chǎn)物的增加而成比例的增長。熒光劑分子吸收光線中狹小波長的光子，能被染料吸收的光線叫做激發(fā)波長。激發(fā)后的分子處于較高的能量狀態(tài)，持續(xù)時間很短，分子迅速衰退到原先的狀態(tài)。在這個過程中一個光子以較長的波長發(fā)散出來，對于每一個熒光染料都有一個優(yōu)化的激發(fā)和發(fā)散波長。在狹窄的優(yōu)化波長范圍內(nèi)，熒光分子能被激發(fā)或檢測到。熒光實驗主要要求在初和后的10個PCR循環(huán)中信號強度有盡可能大的差異。個熒光劑染料分子（donor或reporter）由外部的優(yōu)化波長光線激活后，釋放出較長波的光線去激活臨近的另一個分子（acceptor），這樣的過程稱為三角洲。接受光線的分子可能會也可能不會釋放出光線。每一次的轉(zhuǎn)發(fā)過程都會使波長有所增加，直至real-time設(shè)備能接收到。Real-time PCR的熒光劑按照功能區(qū)分有3個類型，1. Donor發(fā)散出的熒光信號在實驗過程中被檢測到。2. Acceptor負責冷卻Donor發(fā)出的信號。3. 是參照染料，參照染料不與其他成分產(chǎn)生反應，軟件用它校正不同加樣孔的信號。理論上講，熒光劑染料可以成為reporter。常見的染料有6-FAM (6-carboxy fluorescein)和YBR® Green I，前一種能被由氬離子激光制造的488 nm的波長激發(fā)。6-FAM容易和寡核苷酸結(jié)合釋放出一個強信號。YBR® Green I與6-FAM不同，是一種自由染料。

冷卻分子可以是熒光染料也可以是其他能吸收恰當波長的光線能量的分子，原來和6-FAM一起使用的是TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine)。FAM在靠近TAMAR的位置上有效地吸收光子能量。除此之外，不發(fā)光的黑色染料也可用于reporter。常見的有DABSYL (4-(dimethylamino)azobenzene-4’-sulfonyl chloride)。參照組的熒光信號比較每個加樣孔的不同，保證每個加樣孔的信號在整體上較平穩(wěn)。設(shè)備上的不同會形成加樣孔之間數(shù)值的偏差，叫做“邊緣效應”，要求對每個加樣孔的數(shù)值標準化。但是當邊緣效應過大，內(nèi)側(cè)加樣孔和外側(cè)加樣孔的差距過大就不再適合參照組作為標準化的依據(jù)。常見的參照染料是ROX (6-carboxy-X-rhodamine)

Real-time PCR設(shè)備組成

介紹市場上全部real-time PCR的使用不是明智的事，但是知道基本常識，了解設(shè)備如何工作，設(shè)備結(jié)構(gòu)和物理限制還是有必要的。Real-time PCR有3大部分，光源：這決定了熒光染料的范圍，探測系統(tǒng)：決定了光譜范圍和敏感度。熱循環(huán)機制：決定了每次實驗的速度，樣本間統(tǒng)一的溫度變化，樣本數(shù)量。

Real-time PCR的光源有4種，氬離子激光，LED激光，石英鹵素鎢燈和氙燈。每一種不同的光源決定了設(shè)備的工作能力，氬離子激光主要的工作光譜在488 nm，對reporter來講是個的波長。但在紅光下488 nm給出一個較弱的染料激發(fā)，*過大的500 nm時伴隨弱化的信號。較弱的信號限制reporter 染料的效用。LED激光發(fā)出30-40 nm的光線，輸出的能量比氬離子激光微弱，但能源使用費用較低。常用光源是石英鹵素鎢燈，這種燈泡能發(fā)射出穩(wěn)定的360 nm至1000nm波長的光線，覆蓋全部可見光，有時也叫“白光”。與以上提到的激光不同，需使用2組激發(fā)和散射濾鏡來選擇使用的波長，有些設(shè)備使用光電倍增管和CCD攝像機捕獲信號。氙燈的亮度遠高于石英鹵素鎢燈，波長與其相似。使用5組激發(fā)濾鏡和2組散發(fā)濾鏡。

發(fā)展趨勢

Real-time PCR呈現(xiàn)出3個發(fā)展方向

1.   初的real-time PCR只能處理單一的樣本，現(xiàn)在越來越多的設(shè)備具有更廣闊的運行能力，許多設(shè)備可以提供5至6個新穎的激發(fā)/發(fā)散濾鏡。理論上講，每個反應可以允許5至6個不同的樣本同時實驗。每個reporter釋放出的光線按物理手段分開，

2.   Real-time PCR設(shè)備執(zhí)行熱循環(huán)的能力加強了， 可裝入的樣本數(shù)量增加，化學試劑的改進縮短了了每次運行的時間，縮短時間對于高通量用戶是重要的性能指標。

3.   提高樣本產(chǎn)量。目前產(chǎn)量高的real-time PCR是ABI 7900能夠一次裝入384個樣本，這種容量已經(jīng)*出一般實驗室的需求。但對某些用戶來來講，更高產(chǎn)的設(shè)備1536個樣本處理能力成為標準配置。