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        1. 上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司
          中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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          艾本德
          pcr儀 基因擴(kuò)增儀
          分子生物
          電泳設(shè)備
          IKA RCT Basic磁力攪拌器
          顯微鏡|凝膠成像
          培養(yǎng)箱|搖床
          制冷設(shè)備|恒溫設(shè)備
          光學(xué)儀器
          食品檢測(cè)|農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)儀
          科晶
          通用分析儀器
          細(xì)胞分析
          物理屬性
          滅菌器|生物安全
          電化學(xué)|水質(zhì)測(cè)定儀
          環(huán)衛(wèi)園林
          土壤分析
          藥物測(cè)定
          無(wú)損檢測(cè)儀器
          天平|衡量|力學(xué)
          真空泵|循環(huán)泵|蠕動(dòng)泵
          樣品處理|離心|混合
          過(guò)濾器|純水器
          干燥箱|試驗(yàn)箱|加熱設(shè)備
          光度計(jì)
          便攜式濁度儀
          消解儀
          甲醛測(cè)定儀
          農(nóng)藥殘毒檢測(cè)儀
          溶氧儀
          實(shí)驗(yàn)室設(shè)備
          環(huán)境監(jiān)測(cè)設(shè)備

          詳述Pcr儀的四大分類(lèi)及常見(jiàn)問(wèn)題解答

          時(shí)間:2018/11/15閱讀:2053
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          詳述Pcr儀的四大分類(lèi)及常見(jiàn)問(wèn)題解答

          PCR就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專(zhuān)一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù),可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn),可以將PCR儀分為普通PCR儀,梯度PCR儀,原位PCR儀,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類(lèi)。

          普通PCR儀

          一般把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀,稱(chēng)之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運(yùn)行。主要是用作簡(jiǎn)單的,對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。

          主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、檢疫等。

          梯度PCR儀

          一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱(chēng)之為梯度PCR儀。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同的DNA片段其較為適合的退火溫度不同,通過(guò)設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增,從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的較為適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增,這樣既節(jié)約時(shí)間,也節(jié)約經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。正真的梯度,是每一排管都有的加熱控溫探頭,2009年為止只有美國(guó)ABI公司可以做到。其他的都是從兩頭的熱傳遞來(lái)設(shè)計(jì)控溫。

          梯度PCR儀多應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu)。

          原位PCR儀

          (有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能,通過(guò)替換模塊進(jìn)行多用途開(kāi)展實(shí)驗(yàn)工作)

          是用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀。如病原基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等??杀3旨?xì)胞或組織的完整性,使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中,在細(xì)胞的靶DNA所在的位置進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA,還能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置。于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實(shí)用價(jià)值。

          實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

          在普通PCR儀設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上增加熒光信號(hào)激發(fā)和采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng),形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR擴(kuò)增原理相同,在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記,使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng),得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。

          熒光定量PCR儀有單通道,雙通道和多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候,選用單通道;有多種熒光標(biāo)記的時(shí)候使用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物,因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量,需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)多種目的基因的功能。

          實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。

          PCR儀常見(jiàn)問(wèn)題及回答

          1. cDNA產(chǎn)量的很低
          可能的原因:
          *RNA模板質(zhì)量低
          *對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高
          *反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
          *同位素磷32過(guò)期
          *反應(yīng)體積過(guò)大,不應(yīng)*過(guò)50μl
          2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺
          *較為常見(jiàn)的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
          *與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
          *建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA
          **鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),在總的反應(yīng)體系中的含量不要*過(guò)1/10
          *建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物(GSP)用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu),如環(huán)狀結(jié)果,有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火;或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。
          *目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn),可以試用以下方法解決:
          a. 將*鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
          b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行*鏈反應(yīng)。
          3. 產(chǎn)生非特異性條帶
          *用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶,則需要用DNase I重新處理樣品。
          *在PCR反應(yīng)中,非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火,降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
          *由于mRNA剪切方式的不同,根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

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