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布魯氏菌病檢測(cè)技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：11238 發(fā)布時(shí)間：2011-9-7
布魯氏菌病檢測(cè)技術(shù)
1.概況
布魯氏菌?。ê喎Q布?。怯刹剪斒暇鸬囊环N人畜共患的傳染病。臨床主要特征是母畜流產(chǎn)、乳腺炎、不育和各種組織（如睪丸、關(guān)節(jié)）的炎癥。人類感染布病后，病程長，反復(fù)發(fā)作，長期不愈。布病幾乎遍及世界各地。凡有牲畜的地區(qū)都有布病流行。據(jù)不*統(tǒng)計(jì)，在160個(gè)國家和地區(qū)中就有123個(gè)國家和地區(qū)有布病發(fā)生。我國多見于內(nèi)蒙古、東北，西北等牧區(qū)。在北方農(nóng)區(qū)也有散發(fā)，常呈地地方性流行。
在不良環(huán)境，如抗生素的影響下，本菌易發(fā)生變異，通常變異形成的布魯氏菌可在機(jī)體內(nèi)長期存在。該菌對(duì)熱抵抗力不強(qiáng)，63℃經(jīng)7～10 min可被殺死，在鮮乳中可存活2天到18個(gè)月，在凍肉中可存活14～47天，在干燥土壤和胎兒體內(nèi)可分別存活37天和6個(gè)月。對(duì)常用消毒藥敏感，如0.1％升汞數(shù)分鐘，1％來蘇兒或2％福爾馬林15 min可將其殺死。日光下曝曬4 h可殺死本菌。
人和多種動(dòng)物對(duì)布魯氏菌易感。動(dòng)物中羊、牛、豬的易感性zui強(qiáng)。母畜比公畜，成年畜比幼年畜發(fā)病多。在母畜中，*次妊娠母畜發(fā)病較多。帶菌動(dòng)物，尤其是病畜、流產(chǎn)胎兒、胎衣是主要傳染源。消化道、呼吸道、生殖道是主要的感染途徑，也可通過損傷的皮膚、粘膜等感染。常呈地方性流行。人主要通過皮膚、粘膜和呼吸道感染。
本病一年四季均可發(fā)病。流行區(qū)在發(fā)病高峰季節(jié)（春末夏初）可呈點(diǎn)狀暴發(fā)流行?；疾∨c職業(yè)有密切關(guān)系，如：獸醫(yī)、畜牧工作者、屠宰工人、皮毛工 等感染機(jī)會(huì)較高。
人類布魯氏菌病的預(yù)防，首先要注意職業(yè)性感染，凡在動(dòng)物養(yǎng)殖區(qū)、屠宰區(qū)、畜產(chǎn)品加工廠的工作者以及獸醫(yī)、實(shí)驗(yàn)室工作人員等，必須嚴(yán)守防護(hù)制度（即穿著防護(hù)服裝，做好消毒工作），尤其在仔畜大批生產(chǎn)季節(jié)。更要特別注意。病畜乳肉食品必須滅菌后食用。必要時(shí)可用疫苗接種，接種前應(yīng)行變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。陰性反應(yīng)者才能接種。
2.實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)技術(shù)概述（據(jù)布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范）
2.1檢測(cè)方法 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)或細(xì)菌分離。初篩試驗(yàn)選用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）或乳牛布病全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）（見GB/T 18646）。正式試驗(yàn)選用動(dòng)物布病試管凝集試驗(yàn)（SAT）或動(dòng)物布病補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）（見GB/T 18646）
2.2監(jiān)測(cè)對(duì)象：牛、羊、豬、鹿等動(dòng)物。
2.3監(jiān)測(cè)方法：采用流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)方法，結(jié)合細(xì)菌分離進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
2.4監(jiān)測(cè)范圍、數(shù)量
免疫地區(qū)：對(duì)新生畜、未免疫畜、免疫一年半或口服免疫一年以后的牲畜進(jìn)行監(jiān)測(cè)（豬可在口服免疫半年后進(jìn)行）。監(jiān)測(cè)至少每年進(jìn)行一次，牧區(qū)縣抽檢500頭（只）以上，農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)抽檢200頭（只）以上，交通不便的邊遠(yuǎn)地區(qū)抽檢3個(gè)鄉(xiāng)9個(gè)村50%的牲畜進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)。
非免疫地區(qū)：監(jiān)測(cè)至少每年進(jìn)行一次。達(dá)到控制標(biāo)準(zhǔn)的牧區(qū)縣抽檢1000頭（只）以上，農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)抽檢500頭（只）以上；達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)的牧區(qū)縣抽檢500頭（只）以上，農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)抽檢200頭（只）以上。
所有的奶牛、奶山羊和種畜每年必須進(jìn)行兩次血清學(xué)監(jiān)測(cè)。
2.5監(jiān)測(cè)時(shí)間
對(duì)成年動(dòng)物監(jiān)測(cè)時(shí)，豬、羊在5月齡以上，牛在8月齡以上，懷孕動(dòng)物則在第1胎產(chǎn)后半個(gè)月至1個(gè)月間進(jìn)行；對(duì)S2、M5、S19菌苗免疫接種過的動(dòng)物，在接種后18個(gè)月（豬接種后6個(gè)月）進(jìn)行。
2.6監(jiān)測(cè)結(jié)果的判定與報(bào)告
初篩試驗(yàn)出現(xiàn)陽性反應(yīng)，并有流行病學(xué)史和臨床癥狀或分離出布魯氏菌，判為病畜。
血清學(xué)正式試驗(yàn)中試管凝集試驗(yàn)陽性或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性，判為陽性畜。
判定時(shí)應(yīng)注意排除其它疑似疾病和菌苗接種引起的血清學(xué)反應(yīng)。
按要求使用和填寫監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)告，并及時(shí)上報(bào)。
疫情處理必須嚴(yán)格執(zhí)行《牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范》的有關(guān)要求。
3.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法
實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括以下幾種方法：
3.1細(xì)菌學(xué)檢測(cè)
將樣品剪成小塊，用鑷子夾住直接涂抹在肝湯瓊脂平板上，一式兩份，一份放10%二氧化碳中培養(yǎng)，一份在普通環(huán)境中培養(yǎng)，一般37℃培養(yǎng)10天，布氏桿菌菌落在上述瓊脂板上呈無色、透明、圓形、隆起、表面光滑、均質(zhì)樣的菌落、菌落中央有時(shí)有很小的顆粒，菌落開始微透明，以后逐漸變?yōu)榛鞚幔浯笮〔坏?。挑取菌落涂片鏡檢即可發(fā)現(xiàn)布氏桿菌。
用母畜流產(chǎn)的胎兒組織和胎衣涂片鏡檢也能檢測(cè)到布氏桿菌。
3.2凝集反應(yīng)試驗(yàn)
3.2.1方法
目前對(duì)于布病的診斷多采用凝集反應(yīng)試驗(yàn)，主要檢測(cè)血清或乳中的抗布魯氏菌抗體。常用的監(jiān)測(cè)方法有虎紅平板凝集試驗(yàn)、布病試管凝集試驗(yàn)、全乳環(huán)狀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)?；⒓t平板凝集試驗(yàn)和全乳環(huán)狀試驗(yàn)適用于家畜布病田間篩選試驗(yàn)和乳牛場(chǎng)布病的監(jiān)測(cè)及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗(yàn)；試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。
3.2.2病料
3.2.2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的病料為血清，即按常規(guī)方法采血分離制備的血清，血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血，無腐敗氣味。
3.2.2.2 乳牛布病全乳環(huán)狀試驗(yàn)的病料為新鮮、潔凈的全乳，采樣時(shí)應(yīng)將母畜的乳房用溫水洗凈、擦干，然后將乳液擠入潔凈的器皿中。
3.2.3操作步驟 （僅介紹常用的虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)）
3.2.3.1虎紅平板凝集試驗(yàn)主要的操作過程：
3.2.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清對(duì)照試驗(yàn)
分別吸取陽性血清和陰性血清各0.03ml，分別滴于玻璃板上，在陽、陰性血清旁滴各加0.03ml抗原，用牙簽攪動(dòng)血清和抗原，使之充分混合， 2min時(shí)判斷結(jié)果，陽性血清有凝集現(xiàn)象；陰性血清無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色。
3.2.3.1.2 檢測(cè)樣品
分別吸取待檢血清各0.03ml，滴于玻璃板上，在待檢血清旁各滴加0.03ml抗原，用牙簽攪動(dòng)血清和抗原，使之充分混合，2min時(shí)判斷結(jié)果 。
3.2.3.1.3 結(jié)果判定方法和依據(jù):
在陰、陽性血清對(duì)照成立的條件下，方可對(duì)被檢血清進(jìn)行判定；受檢血清4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（-）。
3.2.3.2試管凝集試驗(yàn)主要的操作過程：
3.2.3.2.1 受檢血清的稀釋度：一般情況，牛、馬和駱駝?dòng)?：50，1：100，1：200和1：400四個(gè)稀釋度。大規(guī)模檢疫時(shí)也可只用兩個(gè)稀釋度即牛、馬和駱駝為1：50和1：100；豬、山羊、綿羊和狗為1：25和1：50。
3.2.3.2.2 稀釋血清（以羊、豬為例）和加入抗原的方法：
每份血清用5支小試管（口徑8-10mm），*管加入2.3ml石炭酸生理鹽水，第二管不加，第三、四和第五管各加入0.5ml。用1ml吸管吸取受檢血清0.2ml，加入*管中，并混合均勻?；旌戏椒ǎ菏菍⒃撛嚬苤械幕旌弦何胛軆?nèi)，再沿管壁吹入原試管中，如此吸入、吸出三、四次?；靹蚝螅栽撐芪』旌弦悍謩e加入第二管和第三管，每管0.5ml。以該吸管將第三管的混合液混勻（方法同前）吸取0.5ml加入第四管混合后，又從第四管吸出0.5ml加入第五管，第五管混勻完畢棄去0.5ml。如此稀釋之后從第二管起血清稀釋度分別為1：12.5，1：25，1：50和1：100。
血清規(guī)定用0.5%石炭酸生理鹽水稀釋，但檢驗(yàn)羊血清時(shí)用0.5%石炭酸10%鹽水溶液稀釋。
加入抗原的方法：先以0.5%石炭酸生理鹽水，將抗原原液作20倍稀釋（如果血清用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋則抗原原液亦須用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋）然后加入上述各管（*管不加，留作血清蛋白凝集對(duì)照），每管0.5ml，振搖均勻，加入抗原后，第二管至第五管各管混合液的溶積均為1ml，血清稀釋度從第三管起依次變?yōu)?：25，1：50，1：100和1：200。
牛、馬和駱駝血清稀釋和加抗原法，具體方法與上述的是一致的，不同的是，*管加2.4ml0.5%石炭酸生理鹽水和0.1ml受檢血清，加抗原以后從第二管到五管血清稀釋度為1：50、1：100、1：200和1：400。
3.2.3.2.3 對(duì)照管的制作：
每次試驗(yàn)須作三種對(duì)照各一份。
陰性血清對(duì)照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清同。
陽性血清對(duì)照：陽性血清對(duì)照須稀釋到其原有滴度，加抗原的方法與受檢血清相同。
抗原對(duì)照（了解抗原是否有自凝現(xiàn)象）：加1：20抗原稀釋液0.5ml于試管中，再加0.5ml0.5%石炭酸生理鹽水（如果血清用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋則也加入0.5%石炭酸，10%鹽水溶液）。
3.2.3.2.4 比濁管的制作：
每次試驗(yàn)須配制比濁管作為判定清亮程度（凝集反應(yīng)程度）的依據(jù)，配制方法如下：取本次試驗(yàn)用的抗原稀釋液（即抗原原液20倍稀釋液）5—10ml加入等量的0.5%石炭酸生理鹽水（如果血清用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋則加入0.5%石炭酸，10%鹽
水溶液）作對(duì)倍稀釋，然后按下表配制比濁管。
| 管號(hào) | | 抗原稀釋液（ml） | | 石炭酸生理鹽水（ml） | 清亮度 | | 標(biāo)記 |
| 1 | | 0.0 | | 1.0 | 100% | | + + + + |
| 2 | | 0.25 | | 0.75 | 75% | | + + + |
| 3 | | 0.50 | | 0.50 | 50% | | + + |
| 4 | | 0.75 | | 0.25 | 25% | | + |
| 5 | | 1.0 | | 0.0 | 0% | | — |
3.2.3.2.6 記錄結(jié)果：
根據(jù)各管中上層液體的清亮度記錄凝集反應(yīng)的強(qiáng)度（凝集價(jià)）特別是50%清亮度（即“+ +”的凝集）對(duì)判定結(jié)果關(guān)系很大。需用比濁管對(duì)照判定。
+ + + +：等于*凝集和沉淀，上層液體100%清亮（即100%菌體下沉）。
+ + +：等于幾乎*凝集和沉淀，上層液體75%清亮。
+ +：等于顯著凝集和沉淀，液體50%清亮。
+：等于沉淀明顯，液體25%清亮。
—：等于無沉淀，不清亮。
確定每份血清的效價(jià)時(shí)，應(yīng)以出現(xiàn)兩個(gè)“+ +”以上的凝集現(xiàn)象（即50%的清亮）的zui高血清稀釋度為血清的凝集價(jià)。
3.2.3.2.7 試驗(yàn)結(jié)果的判定
3.2.3.2.7.1 牛、馬和駱駝?dòng)?：100稀釋度，豬、山羊、綿羊和狗于1：50稀釋度出現(xiàn)兩個(gè)加號(hào)以上的凝集現(xiàn)象時(shí)，被檢血清判定為陽性反應(yīng)。牛、馬和駱駝?dòng)?：50稀釋度，豬、山羊、綿羊和狗于1：25稀釋度出現(xiàn)兩個(gè)加號(hào)以上凝集現(xiàn)象，被檢血清判定為可疑反應(yīng)。
3.2.3.2.7.2 可疑反應(yīng)的牲畜，經(jīng)3—4周，須重新采血檢驗(yàn)，在牛和羊，如果重檢時(shí)仍為可疑，該畜判定為陽性。在豬和馬重檢時(shí)，如果凝集價(jià)仍然保持可疑反應(yīng)水平，而農(nóng)場(chǎng)的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性反應(yīng)的患畜出項(xiàng)，該畜血清判定為陰性。
3.2.3.2.7.3 鑒于豬血清常有個(gè)別出現(xiàn)非特異性凝集反應(yīng)，在試驗(yàn)時(shí)須結(jié)合流行病學(xué)判定結(jié)果。如果受檢血清中有個(gè)別出現(xiàn)弱陽性反應(yīng)（例如凝集價(jià)為1：100—1：200），但豬群中所有的豬只均無布氏桿菌病臨床癥狀（流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎、睪丸炎等），可考慮此種反應(yīng)為非特異性，經(jīng)3—4周可采血重檢。
3.2.3.2.7.4 將試驗(yàn)結(jié)果通知畜主時(shí)，須注明凝集價(jià)。
3.3直接檢測(cè)病料中的病原
應(yīng)用免疫酶組化直接法、間接法及SPA法檢測(cè)病料中的布魯氏菌，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)布魯氏菌，應(yīng)在實(shí)際工作中加以應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)的具體操作方法，按照使用說明書操作。
4.防治措施
4.1加強(qiáng)檢疫。引種時(shí)檢疫，引入后隔離觀察一個(gè)月，確認(rèn)健康后方能合群。
4.2定期預(yù)防注射。布魯氏桿菌19號(hào)弱毒菌苗或凍干布氏桿菌羊5號(hào)弱毒菌苗可于成年母牛每年配種前1——2個(gè)月注射，免疫期一年。
4.3嚴(yán)格消毒。對(duì)病牛污染的圈舍、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、飼槽、臥床、等用5%克遼林、5%來蘇兒、10%—20%石灰乳或2%氫氧化鈉等消毒；病牛皮用3%——5%來蘇兒浸泡24h后用；乳汁煮沸消毒；糞便發(fā)酵處理。
4.4培育健康幼畜。約占50%的隱性病牛，在隔離飼養(yǎng)條件下，可經(jīng)2——4年而自然*；在奶牛場(chǎng)，可用健康公牛的精液人工授精，犢牛出生后食母乳3—5d送犢牛隔離舍喂以消毒和健康乳；6個(gè)月后作間隔為5——6周的兩次檢疫，陰性者送入健康牛群；陽性者送入病牛群，從而達(dá)到逐步更新、凈化牛場(chǎng)的目的。對(duì)流產(chǎn)后繼發(fā)子宮內(nèi)膜炎的病牛，可用1%高錳酸鉀沖洗子宮和陰道，每天1——2次，經(jīng)2——3天后隔日一次，直至陰道無分泌物流出為止。
【處方1】益母草50g，黃芩30g，川芎、當(dāng)歸、熟地、白術(shù)、雙花、連翹、白芍各25g、甘草20。共為細(xì)末，開水沖服。本方適用患病母牛
【處方2】對(duì)嚴(yán)重的母牛，采取全身治療的方法，如炎毒菌克（注射用硫酸鏈霉素 4g）靜脈注射每千克體重30mg。
【處方3】鹽酸四環(huán)素，5-10mg/kg體重，肌內(nèi)注射或靜脈注射，每日2次，劑量加倍，連用2-3 周。